蛋白组学

6. 染色的选择OO. Western Blot哪种染色好？解答：（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。（2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但 ...

9. 条件的摸索 DDD. 用的是Santa Cruz的抗体，也实验过一抗和二抗肯定能结合，二抗加DAB肯定能显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与Marker对应的条带是否是我要的（我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD）。半干法2小时转膜后，丽春红染色发现大分子量蛋白转过去的较少。难道是裂解液出了问题？我用的是三去污剂，但没加叠氮钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂。冰上 ...

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（ ...

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（ ...

前两天做了一个western blot现在把试验中的一点小小的体会发上来，与大家交流，希望大家多多指点！1 本实验室采用的脱脂奶粉已经存放了近两年了，虽然是四摄氏度保存，但是其封闭质量还是难以保证的。所以本人的试验结果中出现了小斑点。建议最好使用BSA或专用的脱脂奶粉进行封闭，虽然贵点，但还是有个好点的结果比较好。2 本人采用的是过夜封闭方法，虽然时间长，想想封闭效果应该是没有什么问题，但是一定要 ...

EDTA和Tris的混合液配方：Tris-Cl (pH7.4) 20mM，EDTA 1mM.可加入蛋白酶抑制剂提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。⑴ 匀浆 对于组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。⑵ 12000g离心，4℃，2min。⑶ 取少量上清进行定量。⑷ 将所有蛋白样品调至等 ...

前两天做了一个western blot现在把试验中的一点小小的体会发上来，与大家交流，希望大家多多指点！1 本实验室采用的脱脂奶粉已经存放了近两年了，虽然是四摄氏度保存，但是其封闭质量还是难以保证的。所以本人的试验结果中出现了小斑点。建议最好使用BSA或专用的脱脂奶粉进行封闭，虽然贵点，但还是有个好点的结果比较好。2 本人采用的是过夜封闭方法，虽然时间长，想想封闭效果应该是没有什么问题，但是一定要 ...

这是偶整理的蛋白裂解和提取的protocol，希望对大家有所帮助。10ml 三去污裂解液配方如下：50 mmol/L Tris-cl (pH 8.0)： 0.07882g 150 mmol/L NaCl： 0.08775g0.2 g/L叠氮钠： 0.002g 1 g/LSDS 0.01g100 mg/L Aprotin 0.001g10 g/L NP-40 0.1g 5 g/L去氧胆酸钠 0.05 ...

EDTA和Tris的混合液配方：Tris-Cl (pH7.4) 20mM，EDTA 1mM.可加入蛋白酶抑制剂提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。⑴ 匀浆 对于组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。⑵ 12000g离心，4℃，2min。⑶ 取少量上清进行定量。⑷ 将所有蛋白样品调至等 ...

这是偶整理的蛋白裂解和提取的protocol，希望对大家有所帮助。10ml 三去污裂解液配方如下：50 mmol/L Tris-cl (pH 8.0)： 0.07882g 150 mmol/L NaCl： 0.08775g0.2 g/L叠氮钠： 0.002g 1 g/LSDS 0.01g100 mg/L Aprotin 0.001g10 g/L NP-40 0.1g 5 g/L去氧胆酸钠 0.05 ...

WESTERN BLOT PROTOCOLIn a Western blot proteins that are separated on polyacrylamide gels on the basis of size are transferred to a membrane for detection with antibodies.Preparation of Human Cell Ext ...

酶的分离纯化方法简介生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细 ...

酶的分离纯化方法简介生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细 ...

Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15000转/分1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃ 约20000 g（约150 ...

一、提取抗原蛋白将提取RNA途中留存的样品，加入150μl 100%酒精充分混匀，静置5min(RT) 2000×g 4℃离心5min 吸取上清至新管中 加入750μl异丙醇 混匀 静置10min(RT) 12000×g 4℃离心10min 弃上清 加入1ml 0.3mol/L盐酸胍/95%酒精重悬沉淀 用加样器打散沉淀 混旋20~30秒 静置20min(RT) 7500×g 4℃离心5min ...

培养基上清直接电泳跑出来的条带经常很难看，可以TCA沉淀浓缩后跑电泳，一般表达量大于1mg/ml可以看到明显条带，这是我用的TCA沉淀方法，效果很好：1.菌液10000g离心5分钟，收集表达上清。2.取500-1000ul上清于EP管中，加入1/9体积的100％TCA，颠倒10次混匀。3.样品置于冰浴中大于0.5小时，过夜效果更好。4.15000g离心10－20分钟可见有棕黑色沉淀，倒掉上清，将E ...

1） 将醋酸纤维素薄膜置于MD/His -平板的His + 转化子菌落上用涂布棒轻压使醋酸纤维素薄膜完全湿润并赶尽气泡 使所有菌落转移到醋酸纤维素薄膜上.2) 在BMMY板上置一同样大小的硝酸纤维素薄膜 并将醋酸纤维素薄膜菌落向上置于硝酸纤维素薄膜上. 30 ℃孵育18 h 后 将醋酸纤维素薄膜移至MDP2His 平板上 4 ℃保存3) 将硝酸纤维素薄膜取下 6 %小牛血清37 ℃封闭2 h T ...

培养基上清直接电泳跑出来的条带经常很难看，可以TCA沉淀浓缩后跑电泳，一般表达量大于1mg/ml可以看到明显条带，这是我用的TCA沉淀方法，效果很好：1.菌液10000g离心5分钟，收集表达上清。2.取500-1000ul上清于EP管中，加入1/9体积的100％TCA，颠倒10次混匀。3.样品置于冰浴中大于0.5小时，过夜效果更好。4.15000g离心10－20分钟可见有棕黑色沉淀，倒掉上清，将E ...

1。根据序列比对，相似性分析，初步估计蛋白质可能的功能2。查阅文献，看有否相关研究3。如果用血清，在未知功能情况下，很难有所作为，建议等初步知道功能后，用血清是验证抉具体作用的4。比较常用的未知基因分析方法，是从基因水平入手：将该基因敲除(现在可以考虑RNAi)，看看在功能组、蛋白组、转录组等等有何改变？形态等宏观水平有否改变？将该基因过表达(转入表达载体，或用小分子特异上调该基因？)，看看是否有 ...

HPLC 优点：高压 速度快 分析精度高 所需样本量少，主要用于分析 纯化多肽类缺点：柱子较贵 有些需要用乙氰甲醇等有毒有害试剂 不能或只能纯化 很小量的蛋白AKTA 系统 优点： 中低压 容易放大 可大规模纯化蛋白类 常规只用无机盐类试剂 可配备各种介质纯化不同蛋白 可自己灌胶 费用较少缺点：分析精度没有HPLC高选用HPLC或AKTA的FPLC主要是依据你的用途而买，分析用HPLC 大规模纯化 ...