Western Blot Protocol
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一、提取抗原蛋白
将提取 RNA 途中留存的样品，加入 150μl 100% 酒精充分混匀，静置 5min(RT), 2000 × g , 4 ℃离心 5min, 吸取上清至新管中 , 加入 750μl 异丙醇 , 混匀 , 静置 10min(RT), 12000 × g, 4 ℃离心 10min, 弃上清 , 加入 1ml 0.3mol/L 盐酸胍 /95% 酒精重悬沉淀 ,
用加样器打散沉淀 , 混旋 20~30 秒 , 静置 20min(RT) , 7500 × g, 4 ℃离心 5min, 弃上清 , 重新加入 1ml 0.3mol/L 盐酸胍 /95% 酒精两次 , 重悬沉淀 , 离心后弃上清 , 加入 100% 无水乙醇 1ml, 混旋 1min, 静置 20min(RT), 7500 × g, 4 ℃离心 5min, 弃上清 , 真空干燥 5min , 50μl 1%SDS 溶解沉淀，用 50 ℃热水助溶，直至全部溶解。 10000 × g, 离心 10min, 去除沉渣。
二、蛋白定量
1. 取 PBS 、各样品 10 ul ，加 DW 990 ul
2. 取 DW 匀浆缓冲液、样品稀释液、系列牛血清白蛋白标准浓度 0.5 ml 。
3. 向各管加入 2.5 ml D 试剂（ A50ml ＋ B0.5ml ＋ C0.5ml A － 2% [陈星云1] [ 陈星云 1] Na2 CO3 、 0.1N NaOH ， B － 0.5%CuSO4 ， C － 1% 酒石酸钠）混匀，静置 10 分钟。
4. 迅速加入酚试剂 0.25ml ，混匀 37 ℃ 水浴 30 分钟。
5. 721 分光光度计 650 nm ，比色， S0 标准管调零。
6. 最后稀释为 4 ug /ul ，加载样缓冲液后，终浓度为 2ug / ul ，上样量为 30 ～ 80ug / 泳道。
三、电泳
1. make gel ．
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11% 分离胶 12ml 两块胶
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4% 积层胶 6ml 两块胶
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DW 4.36 ml
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DW 堵漏 3.66ml
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3M Tris 3.0 ml
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0.5M Tris 1.5 ml
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30%Arc 4.4 ml
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30%Arc 0.5 ml 0.78 ml
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10%SDS 0.24 ml
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10%SDS 60 ul
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10%APS 0.12 ml
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10%APS 20ul 30 ul
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TEMED 10ul
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TEMED 5ul 6ul
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2. 上样前样品处理：
样品 100 ℃、 3 分钟、冷却， 900 × g 、离心 30 S 。
3. 通电电： 积层胶电泳电压 50V 左右，分离胶电泳电压 90 ～ 110V 。
4. 考马斯亮蓝染色： 1 小时， 1 号脱色 1 小时， 2 号脱色 2 小时。
四、电转印
1. 将滤纸 NcM 切成与凝胶尺寸大小，置于 DM 中浸透 5 分钟，电转液平衡 15 分钟。
2. 转移：用二张大滤纸贴于两张多孔垫料，将 NcM 、胶夹于中间，在 NcM 与大滤纸之间垫小滤纸。 NcM 朝正极， 20V 恒压转移 12 小时。取下 NcM 杂交，凝胶染色看效果。
五、杂交
1. 取下 NcM ，做好标记， dH2 O 冲洗，室温滤纸干或放入膜固定液 15 分钟。
2. NcM 用 PBS 冲洗二遍，呈 5 ～ 6% non － fat milk 的 pH7.2 的 PBS 中封闭，室温 ６－８小时或室温 1 － 2 小时， 4 ℃，过夜。
3. 将封闭的膜用ＰＢＳ冲洗一遍，洗 15 分钟× 1 ， 5 分钟× 2 。
4. 加入一抗 1 : 1000 － 1200 ，室温，反应 1 小时
5. PBS 洗 15 分钟× 1 ， 15 分钟× 4 。
6. 加入二抗 1 : 5000 ，室温，反应 1 小时。
7. PBS 洗 15 分钟× 1 ， 5 分钟× 4 。
六、化学发光试剂检测
1. 混合等体积 Bottle1&2 与 NcM 共孵育 1 分钟。
2. 放射自显影：曝光 3 分钟至 10 分钟。
3. 显影后清水漂洗，再定影。
七、所用试剂
1 、匀浆缓冲液 4 × 1L ：
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NaH2 PO4 （・ H2 O ）
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12.48g
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Na2 PO4 ・ 12H2 O
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114.6g
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NaCl
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3.6g
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dw 800ml, adjust pH to 7.0, adjust Vol to 1 L
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（ 1 ）用时稀释 4 倍。
（ 2 ） 40ml PBS ＋ PMSF 40 ul ＋ 1.10 phenautehroline 80 ul ＋ Iodo 80ul ＋ pepstalmA 80ul
2. 系列牛血清蛋白浓度稀释法：
取 500ug / ml BSA 按下法配制：
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500ug / ml BSA
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NS
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蛋白浓度 ug / ml
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S1
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50 ul
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1.95 ml
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12.5
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S2
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100 ul
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1.90 ml
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25
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S3
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200 ul
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1.80 ml
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50
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S4
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400 ul
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1.60 ml
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100
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S5
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800 ul
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1.20 ml
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200
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3. 30%Acrylamide
29.2g 单丙、 0.8g 双丙溶解于 60 mlDDW ，调 Vol 到 100 ml
4. 3M Tris － Hcl buffer pH 8.9 100ml.
称 Tris 36.3g 溶于水 到 100 ml ，调 pH 到 8.9
5. 0.5 M Tris － Hcl buffer pH 6.7 100ml
称 Tris5.98g 溶解后，调 pH 到 6.7 ，调体积 到 100ml
6. Samples buffer 10ml
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10%SDS
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2 ml
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甘油
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1 ml
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0.5M Tris
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1.6 ml
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用前按 9 : 0.5 : 加 0.1 溴酚兰、 0.5% DTT 贮备液。
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DDW
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5.2 ml
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7. 电转液 1L pH 8.2 － 8.3
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Glycine
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14.42 g
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Tris base
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3.02 g
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dH2 O
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800 ml
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Methanol
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200 ml
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10% SDS
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2 ml
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8. pH 7.2 PBS 2 L
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NaCl
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18.0g
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KCl
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0.44g
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Na2 HPO4
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2.84g （ 7.16g ）
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NaH2 PO4
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0.432g （ 0.562g ）
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加 DW 到 2 L
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9. 10 ×电极缓冲液 400 ml pH 8.4
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Tris base
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12.2 g
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甘氨酸
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57.76 g
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加 DW 400 ml, 调 pH8.4 ，用前加 SDS0.1%
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10. 脱色液 1 号
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甲醇
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250 ml
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冰醋酸
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50 ml
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＋ DW 到 500 ml
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11. 脱色液 2 号
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甲醇
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100 ml
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冰醋酸
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75 ml
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＋ DW 到 1000 ml
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