western-blot

2011年鄙人做western的时候，发现目前的资料都很老，网上的资料也大多互相传抄，说法各异，于是综合了目前网上所能找到的资料和个人实际经验，编辑了这份western blot操作步骤2012版，内容包括主要操作步骤和所需要注意的有用的细节，并附上参考文献（原谅我无法像Endnote那样一一注明文献出处，只能大概标注出引用的参考资料），希望对大家有帮助。鄙人按下文的步骤操作已经做出来了稳定可重复的、背景干净的w ...

蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜（湿式转膜）1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，小心取出带有凝胶的玻板，用割胶刀沿下边缘小心撬开短板，按样品的多少切下合适大小的凝胶。浸泡在转膜缓冲液中5分钟左右，以平衡离子强度。视情况决定是否切角标记。 2）电用结束前，应泡好3M滤纸2-6张均可（普通滤纸也可）和1张硝酸纤维素滤膜。 3）戴上手套按如下顺序安装转移装置： a.平放底部电极（阴极），放一张海绵垫片。 b.在海绵垫片上放置1- ...

1. 参考书推荐A. 对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。2. 针对样品的常见问题B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是 ...

1. 在western实验中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，在使用中有什么区别？　　选择合适的缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS在PH7.0以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层 ...

1.抗体的选择对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。在这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多 ...

自我总结的Westen Blot步骤，简单实用！蛋白质的提取（整个过程冰上进行）一．组织膜蛋白裂解液 bufferA+1%蛋白酶抑制剂蛋白保存液 40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先用去离子水冲洗，用纸吸干水)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，15 ...

成功经验听多了，偶尔也要谈谈失败的经验，大家引以为戒。师弟师妹们试验出了问题，凡是我犯过错的都能很快指正。大家做过什么失败的实验，都来分享一下吧~最好附上解决的办法，错了没事，改了就好。你有啥不开心的啊，说出来大家高兴高兴~~1、SDS-PAGE不拆胶条电压调到120V,电流就是上不去，跑了三四个小时之后，师姐过来一看，你胶条都没拆呢！还跑那么久！2、内外板放反。低的一面冲外。不知道大家用的电泳槽是不是一样，里面低一些的 ...

做了五个月的Western Blot ，有一点点小心得，给新手点经验．蛋白提取：１． 总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）：组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加undefinedPBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加 A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行（1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的 ...

好的抗体对做好Western blot非常重要，但新手在刚接触Western blot时，会面临一抗选择的困惑：单抗还是多抗？这个问题，不同的人又有不同的回答，究竟选择的依据是怎样的？欢迎大家按格式跟帖讨论，我们会评选出10名回答出色的幸运网友，送上10个丁当。跟帖格式：示例：从实验室经费是否充裕这个角度出发，经费宽裕选单抗，资金不宽裕就选多抗。（仅供参考格式）提供部分站友的回答，抛砖引玉：@frankcai ，认为：一般来说单 ...

工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶 ...

蛋白质的检测与分析——Western blot一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质（或酶）。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为Western（西）印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一 ...

western blot是现在实验技术中较常用但又不好控制的实验技术。近一月，一直在攻克这个高地，目前尚在努力中，有些心得想给大家聊聊。希望对大家的实验有点点帮助。1)蛋白提取和定量：A.组织蛋白提取过程中，匀浆是一个多因素影响的过程，除了根据实验目的要加入各种蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等之外，匀浆操作本身也有讲究。在其他条件都一致的情况下，匀浆操作尽量是一个人进行（手法一致，否则蛋白浓度和含量有差异）。B.所提取的蛋白 ...

我做了半年western blotting了，p53，p15都能做出来，就是做不出来p21和p27.万般无奈，买了CST的9932#cell cycle sample kit，可还是做不出来。上周给CST发了质量投诉报告，老外处理的很积极，5天之内就给我发来了反馈意见。我的操作基本上是按照CST的说明书进行。只有一点不同，我制备蛋白样品的时候用1毫升注射器在冰浴中反复快速抽吸RIPA-细胞悬液，直到液体清亮为止。我没有按说明书上 ...

http://www.ab-mart.com.cn/content400102.aspx一、样品制备对于Western Blotting实验而言，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白样品必须均质、可溶，并解离成单个多肽亚基，且尽量减少相互间的聚集，使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。当目标蛋白的含量很低时，需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器（如核抽提物），或者通过免疫沉淀等方式进行富集。通常样品有重组蛋白、细胞和组织等 ...

WESTERN BLOT 操作1一 裂解细胞提取蛋白.1试剂/溶液裂解液10ml 10% SDS10ml 甘油10ml β-巯基乙醇8ml 0.5M Tris Ph6.81ml 0.1% 溴酚蓝51ml 单蒸水2方法1)将培养的细胞消化离心,数量需达到106,(可用PBS洗一次.)2)重悬细胞于100μl加热得裂解液,搅拌并煮沸5-10分钟,破坏DNA.3)冷却(但不能在冰上,否则SDS会沉淀),离心收集液相.4)振荡混合.5)得到样品.6)样品储存于-20度备用.二 SDS-聚丙酰 ...

做了五个月的ＷＢ，有一点点小心得，给新手点经验．蛋白提取：１．总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）：组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加undefinedPBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加 A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行（1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入 10ml B ...

版内常看到WB内参问题，看到一篇文章，觉得不错，转帖在此。http://blog.bioon.com/user3/23049/archives/2007/137682.shtmlWestern Blot 内参选择　作者:明日百傲要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺 ...

以前自己总结的Western Blot经验。原先看到版上WB资料泛滥，不想发了。但是后来想想存在电脑里也是浪费，还不如共享一下：）希望对大家有用！1、缓冲液的选择，是用PBS/PBST，还是用TBS/TBST？（1）PBS/PBST不适合AP系列，TBS/TBST适合AP和HRP体系。（2）另外,做磷酸化蛋白的WB，PBS不合适。2、如果用HRP体系，那么不能用叠氮钠做防腐剂。因为叠氮钠会抑制HRP的作用。3、WB中抗体的选择：单 ...

在正文开始之前，请允许小妹我简单介绍一下个人情况，顺带为即将独自一人做此实验的xdjm们打打气。小妹我上无师兄师姐（上届师姐于我开始做实验时已毕业），下无师弟师妹（下届师弟师妹尚未开学），由于种种原因被老板发配到外院一个生物治疗中心进行我的实验。在我开始做Western时，制胶器及转膜仪等均未开封，老师们均表示以前也未做过Western。所以我是第一个吃螃蟹的人，吃苦或许是注定的。我自己找了一个常做Wester ...

读硕士时曾经想发表的关于蛋白印迹法（Western blot）的使用体会，但因为缺少较多样本对比分析，所以没有投得出。但我觉得实验中经过一些挫折后得到些体会，应该与大家分享一下。否则有点可惜了。也希望由此获得加分机会。蛋白印迹法的使用体会蛋白印迹法（Western blot）是分子生物学实验中研究蛋白质的一种重要方法。可用来半定量测定标本中的目的蛋白。由于标本中目的蛋白含量有限，为提高检出率，最后一步可以用化学发光法替 ...