我翻译的wetern blotting 操作方法!很详细!
丁香园论坛
1856
WESTERN BLOT 操作1
一 裂解细胞提取蛋白.
1 试剂/溶液
裂解液
10ml 10% SDS
10ml 甘油
10ml β-巯基乙醇
8ml 0.5M Tris Ph6.8
1ml 0.1% 溴酚蓝
51ml 单蒸水
2 方法
1) 将培养的细胞消化离心,数量需达到106,(可用PBS洗一次.)
2) 重悬细胞于100μl加热得裂解液,搅拌并煮沸5-10分钟,破坏DNA.
3) 冷却(但不能在冰上,否则SDS会沉淀),离心收集液相.
4) 振荡混合.
5) 得到样品.
6) 样品储存于-20度备用.
二 SDS-聚丙酰胺凝胶电泳和western blotting.
1 试剂/溶液
丙烯酰胺-聚丙烯酰胺:40%的37.5:1的比例.
分离胶缓冲液(1.5M Tris-HCL pH8.8)
10%的
TEMED
三水戊醇
成层胶缓冲液(0.5M Tris-HCL Ph 6.8)
5x 电泳缓冲液 (45g Tris 碱,216g甘氨酸,15g SDS,加单蒸水至体积三升.)
印迹缓冲液(15.15g Tris 碱,72.10g 甘氨酸,1L甲醇,加水至总体积5L.)
考马斯蓝染色(0.25g 考马斯蓝R250,125ml甲醇,25ml醋酸,加水至总体积1L)
脱色液(100ml 甲醇,100ml醋酸, 加水至总体积1L)
凝胶防腐液(100ml 醋酸,100ml甘油, 加水至总体积1L)
印迹洗液(150mM NaCL,100mM 马来酸,用NaOH调Ph值至7.5;0.3% Tween-20)
印迹阻断缓冲液(10%w/v 核酸阻断试剂存于印迹洗液)
一抗(小鼠)
碱性磷酸酶结合二抗(羊抗鼠)
碱性磷酸酶缓冲液(100mM 二乙醇胺,pH 10.0,5mM MgCl2)
75mg/ml 四唑氮蓝(NBT,溶于70%的二甲酰胺)
25mg/ml 磷酸甲苯胺盐(BCIP,溶于100%的二甲酰胺)
3 方法
分离胶
6%的丙烯酰胺,每50ml胶中(丙烯酰胺/聚丙烯酰胺 40%混合物 7.5ml,基层胶
缓冲液 16.7ml,水25.3ml)
10%的丙烯酰胺, 每50ml胶中(丙烯酰胺/聚丙烯酰胺 40%混合物12.5ml, 基层胶16.7ml,水20.8ml)
20%的丙烯酰胺, 每50ml胶中(丙烯酰胺/聚丙烯酰胺 40%混合物25ml, 基层胶缓冲液 16.7ml,水8.4ml)
1 将上述溶液混合,赶尽气泡,加入分离胶(每50ml胶含SDS 0.5ml,过硫酸铵0.5ml,TEMED40ml)
2 混悬使其混合,倒出.不要将玻璃板间的空隙完全填满,在上部留3cm注入积层胶.
3 用4ml水饱和三水戊醇覆盖,放置至少30min.
4 弃去三水戊醇,用水彻底清洗.
5 用滤纸吸去多余的水分.
6 沿嵌在一角的梳子倒入积层胶(可避免产生气泡)
5%积层胶配方(每25ml胶)
积层胶缓冲液 3.5ml, 40%的丙烯酰胺/聚丙烯酰胺混合物 3.125ml,水18.375ml
排处气泡
SDS 0.25ml, 过硫酸铵0.25ml,TEMED 20μl.
7 加入梳子,固定至少30min.
方法-跑胶
1 准备器具,包括冷却循环,用水洗细胞.
2 用1800ml水稀释450ml 5x电泳缓冲液,确保上层缓冲液槽不会渗漏.
3 加入30ul细胞裂解物.
4 加入5ul适当的分子量标记(marker)
5 于浓缩胶在100-150伏跑样.
6 在150伏跑3h或40伏过夜.
7 在使用后将电泳缓冲液弃去.
方法-湿法印迹
1 浸泡附着于培养皿的胶于印迹缓冲液30min.
2 裁硝化纤维素膜和2张..
3 浸泡印迹垫,3M纸和硝化纤维素膜于印迹缓冲液.
4 放置转移暗盒,如下图所示.
5 在至少100v或0.8A 电印迹2.5-3.5h,同时冷却.
6 从转移装置上移去暗盒,移去上层的还没垫和3M纸. 切下胶和膜, 移去溴酚蓝染色front和浓缩胶.
7 收集并过滤印迹缓冲液,这一缓冲液可以重复使用3次.
普通蛋白质定量
1 用考马斯蓝染电印迹胶2-24h, 使用过的染料可以重复使用多次.
2 用脱色液多次洗涤脱色,胶可以在这一状态保存好几天.
3 在胶防腐溶液中浸泡1h.
4 在厚吸墨纸上干燥凝胶,用加热的凝胶干燥器和真空泵.
特异蛋白检测
1 简要地洗膜(5min),于印迹洗涤缓冲液.
2 在1%的阻断液中( 印迹阻断缓冲液原液与洗涤缓冲液以1:9体积比混合)培养1-2h..
3 在一抗溶液培养1h(根据需要可延长).将购买抗体于1%阻断缓冲液1:50稀释(体积比) 杂交瘤直接使用其上清. 稀释的抗体溶液和杂交上清在初次使用前应加入叠氮化钠(0.1%w/v)灭菌.
4 在清洗液中洗印迹3次,每次5min.
5 在二抗溶液(ALP结合羊抗鼠抗体,于1%阻断缓冲液中稀释到1:2500v
/v),抚育印迹1-2 h.
6 在清洗液洗5min.
7 将印迹转移到另一清洁容器,在清洗液中洗印迹2次,每次10min.
8 在碱性磷酸酶缓冲液中抚育印迹5min.
9 暗处抚育印迹于20ml铬精chromogen(90ulNBT液+140ulBCIP液加于碱性磷酸酶缓冲液),直到期望的条带出现.这一时间依情况而定(几秒-几小时-过夜均有可能.)
10用水或TE液(10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA pH 8.0)多次洗涤, 停止chromogen反应.
11 在膜湿的时候记录结果,干燥后会有一定的褪色,但用水湿后可以恢复.
12 干燥膜并保存于凉爽黑暗的地方.
1-8及第10步可常规移动操作,第9步尽量不要移动印迹.
一 裂解细胞提取蛋白.
1 试剂/溶液
裂解液
10ml 10% SDS
10ml 甘油
10ml β-巯基乙醇
8ml 0.5M Tris Ph6.8
1ml 0.1% 溴酚蓝
51ml 单蒸水
2 方法
1) 将培养的细胞消化离心,数量需达到106,(可用PBS洗一次.)
2) 重悬细胞于100μl加热得裂解液,搅拌并煮沸5-10分钟,破坏DNA.
3) 冷却(但不能在冰上,否则SDS会沉淀),离心收集液相.
4) 振荡混合.
5) 得到样品.
6) 样品储存于-20度备用.
二 SDS-聚丙酰胺凝胶电泳和western blotting.
1 试剂/溶液
丙烯酰胺-聚丙烯酰胺:40%的37.5:1的比例.
分离胶缓冲液(1.5M Tris-HCL pH8.8)
10%的
TEMED
三水戊醇
成层胶缓冲液(0.5M Tris-HCL Ph 6.8)
5x 电泳缓冲液 (45g Tris 碱,216g甘氨酸,15g SDS,加单蒸水至体积三升.)
印迹缓冲液(15.15g Tris 碱,72.10g 甘氨酸,1L甲醇,加水至总体积5L.)
考马斯蓝染色(0.25g 考马斯蓝R250,125ml甲醇,25ml醋酸,加水至总体积1L)
脱色液(100ml 甲醇,100ml醋酸, 加水至总体积1L)
凝胶防腐液(100ml 醋酸,100ml甘油, 加水至总体积1L)
印迹洗液(150mM NaCL,100mM 马来酸,用NaOH调Ph值至7.5;0.3% Tween-20)
印迹阻断缓冲液(10%w/v 核酸阻断试剂存于印迹洗液)
一抗(小鼠)
碱性磷酸酶结合二抗(羊抗鼠)
碱性磷酸酶缓冲液(100mM 二乙醇胺,pH 10.0,5mM MgCl2)
75mg/ml 四唑氮蓝(NBT,溶于70%的二甲酰胺)
25mg/ml 磷酸甲苯胺盐(BCIP,溶于100%的二甲酰胺)
3 方法
分离胶
6%的丙烯酰胺,每50ml胶中(丙烯酰胺/聚丙烯酰胺 40%混合物 7.5ml,基层胶
缓冲液 16.7ml,水25.3ml)
10%的丙烯酰胺, 每50ml胶中(丙烯酰胺/聚丙烯酰胺 40%混合物12.5ml, 基层胶16.7ml,水20.8ml)
20%的丙烯酰胺, 每50ml胶中(丙烯酰胺/聚丙烯酰胺 40%混合物25ml, 基层胶缓冲液 16.7ml,水8.4ml)
1 将上述溶液混合,赶尽气泡,加入分离胶(每50ml胶含SDS 0.5ml,过硫酸铵0.5ml,TEMED40ml)
2 混悬使其混合,倒出.不要将玻璃板间的空隙完全填满,在上部留3cm注入积层胶.
3 用4ml水饱和三水戊醇覆盖,放置至少30min.
4 弃去三水戊醇,用水彻底清洗.
5 用滤纸吸去多余的水分.
6 沿嵌在一角的梳子倒入积层胶(可避免产生气泡)
5%积层胶配方(每25ml胶)
积层胶缓冲液 3.5ml, 40%的丙烯酰胺/聚丙烯酰胺混合物 3.125ml,水18.375ml
排处气泡
SDS 0.25ml, 过硫酸铵0.25ml,TEMED 20μl.
7 加入梳子,固定至少30min.
方法-跑胶
1 准备器具,包括冷却循环,用水洗细胞.
2 用1800ml水稀释450ml 5x电泳缓冲液,确保上层缓冲液槽不会渗漏.
3 加入30ul细胞裂解物.
4 加入5ul适当的分子量标记(marker)
5 于浓缩胶在100-150伏跑样.
6 在150伏跑3h或40伏过夜.
7 在使用后将电泳缓冲液弃去.
方法-湿法印迹
1 浸泡附着于培养皿的胶于印迹缓冲液30min.
2 裁硝化纤维素膜和2张..
3 浸泡印迹垫,3M纸和硝化纤维素膜于印迹缓冲液.
4 放置转移暗盒,如下图所示.
5 在至少100v或0.8A 电印迹2.5-3.5h,同时冷却.
6 从转移装置上移去暗盒,移去上层的还没垫和3M纸. 切下胶和膜, 移去溴酚蓝染色front和浓缩胶.
7 收集并过滤印迹缓冲液,这一缓冲液可以重复使用3次.
普通蛋白质定量
1 用考马斯蓝染电印迹胶2-24h, 使用过的染料可以重复使用多次.
2 用脱色液多次洗涤脱色,胶可以在这一状态保存好几天.
3 在胶防腐溶液中浸泡1h.
4 在厚吸墨纸上干燥凝胶,用加热的凝胶干燥器和真空泵.
特异蛋白检测
1 简要地洗膜(5min),于印迹洗涤缓冲液.
2 在1%的阻断液中( 印迹阻断缓冲液原液与洗涤缓冲液以1:9体积比混合)培养1-2h..
3 在一抗溶液培养1h(根据需要可延长).将购买抗体于1%阻断缓冲液1:50稀释(体积比) 杂交瘤直接使用其上清. 稀释的抗体溶液和杂交上清在初次使用前应加入叠氮化钠(0.1%w/v)灭菌.
4 在清洗液中洗印迹3次,每次5min.
5 在二抗溶液(ALP结合羊抗鼠抗体,于1%阻断缓冲液中稀释到1:2500v
/v),抚育印迹1-2 h.
6 在清洗液洗5min.
7 将印迹转移到另一清洁容器,在清洗液中洗印迹2次,每次10min.
8 在碱性磷酸酶缓冲液中抚育印迹5min.
9 暗处抚育印迹于20ml铬精chromogen(90ulNBT液+140ulBCIP液加于碱性磷酸酶缓冲液),直到期望的条带出现.这一时间依情况而定(几秒-几小时-过夜均有可能.)
10用水或TE液(10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA pH 8.0)多次洗涤, 停止chromogen反应.
11 在膜湿的时候记录结果,干燥后会有一定的褪色,但用水湿后可以恢复.
12 干燥膜并保存于凉爽黑暗的地方.
1-8及第10步可常规移动操作,第9步尽量不要移动印迹.
