western-blot

biozk 一抗都是cst的，二抗对照也没有问题，细胞裂解液里有磷酸化酶抑制剂，请问可能是哪里的问题？谢谢。msniu 你说的是正常现象啊。erk细胞内本来就有很多，可以检测到，而p-erk是激活后才有的，有的细胞p-erk是激活的，有的细胞p-erk不是激活的，需要刺激激活。不激活的检测不到。你要是怕实验操作有问题，可以做个用EGF激活的做阳性对照。还有一种情况是，你细胞的erk磷酸化水平低，曝光时间短了，信号没显出来。ma ...

pmlt 我想做nf-kb的激活，请问如果我只用western 做Ikba和p-Ikba的半定量检测可以么？细胞因子 可以，做完WB后用Image软件经行成像分析，可以半定量检测。园子里有很多这方面的帖子，你可以看看。doctormy pmlt wrote:我想做nf-kb的激活，请问如果我只用western 做Ikba和p-Ikba的半定量检测可以么？细胞因子 wrote:可以，做完WB后用Image软件经行成像分析，可以半定量检测。园子里 ...

ccy115 大家请帮帮忙吧！我从MDCK细胞上抽提胞浆蛋白和核蛋白，胞浆蛋白浓度在0.5-1.5mg/ml 之间，核蛋白在1.0-2.5mg/ml之间，然后我各用了10ug蛋白上样量来做Western bolt检测IkB类因子和P65因子，蛋白大小在40KD到65KD之间，用的是半干转50mA,90min,转0.22UmPVDF膜后把胶拿去染色，没残留有目的条带区域蛋白，说明蛋白已经转印在膜上了，但是做了很多次了都没有曝光出条 ...

pengmin8866 各位前辈!我是新手,刚做关于Galectin-3 的实验,要测定血清中的量,不知道用什么方法好.请帮我找找血清中的Galectin-3 的论文及方法啊!万分感激!freecell http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18319555http://d.wanfangdata.com.cn/NSTLQK_NSTL_QK17971240.aspxhttp://www3.interscience ...

qiubiaodsg 我最近在做pull down 实验，先用western blot 标记的是被拉的蛋白，结果片子上是一片白板，连作为对照的input（只有被拉的蛋白）都没曝出来，请各位高手知道一下吧，谢谢。本人western 没有问题。dianaofyezi 如果连对照都没有出来，就首先应该考虑程序流程的问题，无论是否发生了pull down，起码对照应该成立不是么？然后再考虑的是相互作用的蛋白的问题。poriae if the input is not goo ...

yunchenxia 我正在写硕士毕业论文，做了很多关于western检测蛋白质表达的实验，我想问一下这些试验结果是直接将图片贴到论文上还是要用软件对电泳条带进行光密度(OD)分析，然后进行统计，我看到国外的文献直接是贴图片的，国内有一些进行了统计，所以想问一下要不要统计？ 最好解释一下，谢谢。licanming 请问你如果不做统计的话怎么知道组间是有差异的？而且这些差异是否具有统计学意义？而我看的外文文献基本都有做OD， ...

trick 现在大部分的文章做到PKC的活化都是通过western检测磷酸化，这个我也做过，但是不太明显，所以想从pkc转位这个角度做它的活化研究。。但是看了一些文献和综述，conventional pkc和novel pkc这样检测他们的活化都是没有问题的，但是有的综述上说atypical pkc的活化是不发生转位的，因为它相对与前2者缺乏一个佛波酯激活域，但是我也看到一些文献做atypical pkc的活化也是通过做他的 ...

残夜寒馨 各位战友有做FKHRL1的没有阿？请教下做Western 用哪个磷酸化位点好一些呢？Ser 还是Thr好一点呢？谁有什么建议没有。。多谢了！！cstchina 能不能告诉我您做哪方面疾病或模型的研究，或许我可以给您一些推荐！即便您要检测SER也要几个不同的位点需要鉴别。cstchina 能不能告诉我您做哪方面疾病或模型的研究，或许我可以给您一些推荐！即便您要检测SER也要几个不同的位点需要鉴别。残夜寒馨 检测应激后海马的这 ...

文竹竹 我最近做western blotting很郁闷。上周用压片盒压片曝光结果还可以，条带很清楚，可是昨天在同样条件下做的结果，什么条带都没有，是白板。为什么？请高手给予帮助！谢谢！二抗？ECL液？liruonan728 二抗出问题？1、二抗本身失活2、二抗被灭活想一想操作过程有无上述失误liruonan728 二抗出问题？1、二抗本身失活2、二抗被灭活想一想操作过程有无上述失误zhongqiuxie 原因太多。一抗问题可能性更大。 ...

jingjingyufu 我想通过western来观测cullin4a蛋白质在小鼠胚胎成纤维细胞中的表达情况，可是做了很多次的western，条带不出的时候居多，即使出了，条带的大小与目的条带的大小也不一样，要比目标带小20KD左右，cullin4a主要功能是参与蛋白质的泛素降解，会不会是因为蛋白质降解了所以条带变小或是此带是非特异性的条带，想请教一下对cullin4a蛋白了解的高手指点一下，不胜感激！lala ...

yangcroom 请问大家，用western检测肿瘤细胞的 nf-kb p65表达时用的转膜条件是什么？多少V多少分钟？一抗二抗孵多久？我用的是中杉分装的nf-kb p65的抗体。还要注意些什么？yangcroom 顶一下！shichong 100v2h,一抗4°过夜，二抗1hyangcroom 谢谢 shichong ，我准备提总蛋白做的NF-KB，这样能做出来吗？同学转膜用15V30min做MMP-9也做出来了的，请问下转膜的条件和抗体有关吗？ ...

haohuaiyong 各位战友，最近我在做磷酸化STAT3的检测，用cell signaling公司的磷酸化检测抗体与总STAT3抗体做WB，实验组（bFGF+EGF）与阳性对照的磷酸化水平是有增加的，但总STAT3在实验组是减少的而在对照组是强表达的，我看别人的文献都是将总STAT3作为阳性内参一样，应该是不变化的啊，为什么我做了好多次都是不均一的啊？实在是搞不明白，请做过这方面的战友帮忙!谢谢！dzhzh 你的灌注胶 ...

——轻松获得高质量 western blot 条带图

这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。试剂：单去污剂裂解液、0 ...

样品处理及保存（极为重要）1、悬浮细胞样品：把细胞及培养液一起收集到15ml或者50ml离心管中，1500rpm离心3min，弃去上清；加入10ml 冷PBS轻轻吹打，1500rpm，4℃离心3min，弃去上清；反复2次；第二次弃去上清后，用1ml 冷PBS重悬细胞，移入1.5ml微型离心管，2500rpm（500g），4℃离心5分钟，尽量去除所有残留上清，于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况下，一般保存1年，建议尽快检测。 ...

～～～热烈欢迎GE公司於莉女士光临蛋白版～～～通过我版热心战友baiy引荐，我们有幸邀请到GE公司专门从事蛋白质科学研究的於莉女士光临蛋白版进行专题讲座。在此丁香园蛋白质技术讨论版全体版主代表蛋白版会员对于於莉女士的到来表示热烈的欢迎，并对於莉女士带给我们的精彩的讲座致以由衷的谢意。本次讲座将开设两帖：1. 本帖： 於莉女士将在本帖进行讲座； 广大战友可以在本帖跟贴提问。2. 答疑贴： 我们将定期收集整理战友提问统一开贴，於莉女士将 ...

1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS ...

根据自己的实验体会，总结做好WB的一些心得，与大家分享，不当之处欢迎批评指正。叙述的思路就是围绕着实验的每个步骤展开，这样可能更具体些。1．配胶: 该部分较为重要的是配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜。常出现的问题有：A.凝胶出现花纹：此时应检查原料中过硫酸铵（AP）粉末是否受潮B.凝胶聚合时间较长：聚合时间由AP以及TEMED决定，通常在30min左右，AP不新鲜会导致聚合变慢：此外还需注意环境的温度也很重要， ...

个人整理 Western Blot（步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面）1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配 ...

近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一 ...