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抗体孵育——WB真正的难点：抗体的使用是一种艺术，一种抗体一个脾气。对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。无论你如何提高自己的转膜技术，高效和低效之间往往只有数倍的差异，而抗体的效价可以差数千倍以上；同样，正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗，谋求特异性和非特异性背景之间差异的最大化。封闭最短可以缩减到5min：很多人把高背景或者黑板，认定为封闭不充分，其实这也是没有吃透WB（说 ...

抗体孵育——WB真正的难点：抗体的使用是一种艺术，一种抗体一个脾气。对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。无论你如何提高自己的转膜技术，高效和低效之间往往只有数倍的差异，而抗体的效价可以差数千倍以上；同样，正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗，谋求特异性和非特异性背景之间差异的最大化。封闭最短可以缩减到5min：很多人把高背景或者黑板，认定为封闭不充分，其实这也是没有吃透WB（说 ...

转印——转印效率对WB结果的影响并不如书本和网络上宣扬的那么大！首先必须澄清的是，很多时候新手会把WB结果无信号归咎于转膜不够充分，实际上转膜效率对最终结果的影响所占比重并不高，真正取决定性因素的是抗体识别能力的强弱，以及如何正确使用抗体，这个问题下节讨论。有一个简单的例证，Biorad提供的3mm厚滤纸初次使用时，通常转膜效果不理想（从预染的marker深浅可知），但对多数一般丰度的蛋白的检测没有任何影响（建 ...

蛋白电泳：电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆。经验之谈，8%胶最底边约36KDa，10%最底边约25KDa，12%最底部约12KDa。8%胶可以跑300KDa-36KDa之间的任意蛋白，转膜效率对WB结果的的影响都问题不大。12%，180KDa左右，转膜效率对WB结果的影响都问题不大（300KDa蛋白如何，没有尝试过）。电泳一般采用恒流，45mA-55mA（应根据电泳仪器适当调整，要注意仪器最高限压；此条件适合g ...

一、样品制备：1、变性条件——SDS LB直接裂解：用常温或者高温预热过（预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遗忘，LB久煮某些性质会改变）的undefinedSDS LB（或者略高1.undefined）直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6孔板细胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面积比类推。通常条件下，SDS LB都是过量的（因此不一定要严格参考SDS LB稀释比）；如果SDS LB不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会发现tip吸不上来，非常粘 ...

研究信号通路时，特别是对于高通量样本检测，通过传统的WB方法来检测蛋白是一项非常费时费力的工作。为了解决这个问题，科学家开始尝试一种新的方法，希望更加高效，简单，没有任何辐射的来检测这些蛋白，尤其是信号传导研究中的磷酸化蛋白。Cell Based Elisa 提供了这样一种理想的，高效的，直接的检测大量样本的细胞信号通路蛋白的方法。我们通过了解Cell Based Elisa 的实验步骤来解析怎样检测高通量的样本中的蛋白，尤其是信号 ...

研究信号通路时，特别是对于高通量样本检测，通过传统的WB方法来检测蛋白是一项非常费时费力的工作。为了解决这个问题，科学家开始尝试一种新的方法，希望更加高效，简单，没有任何辐射的来检测这些蛋白，尤其是信号传导研究中的磷酸化蛋白。Cell Based Elisa 提供了这样一种理想的，高效的，直接的检测大量样本的细胞信号通路蛋白的方法。我们通过了解Cell Based Elisa 的实验步骤来解析怎样检测高通量的样本中的蛋白，尤其是信号 ...

一、材料和方法1．试剂及耗材蛋白抽提试剂（改进型RIPA配方）BCA蛋白定量试剂盒5×还原样品缓冲液10×Tris-Glycine-SDS电泳缓冲液考马斯亮蓝染色液10×TBSTpH8.0湿转缓冲液PVDF膜，0.22um孔径丽春红染色液PMSF蛋白酶抑制剂封闭液ECL发光液山羊抗兔IgG（H+L），HRP兔抗山羊IgG（H+L），HRPβ-actin鼠单抗2．实验仪器Fresco低温冷冻离心机MultiSkan3酶标 ...

除了抗体原因，转膜是怕是western成败的最关键因素。 看到园子里好多好多人在求助转膜时间，园子为何总结出一系列分子量蛋白转膜的时间呢？少说这对于大多数新手来说，是极好的礼物，说大点，借助丁香园的强势人气，此举可以提高我国一线科研人员WB水平也未必。我觉得好的转膜条件，WB的效率提高数倍不成问题。一起来看看站友们转膜条件的原创分享吧。 蛋白来源：RAW264.7 总蛋白 ...

相关专题 Western Blot内参抗体产品选择专题 检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是western blot。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分 ...

相关专题 Western Blot技术专题Western Blot内参抗体产品选择专题 内参抗体种类很多，比如β-actin、β-tubunlin、GAPDH、Lamin B等，那么针对自己的实验，我们该如何选择呢?下面简单介绍下选择内参抗体应遵循的原则： 一.样本种属来源： 首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。 1、 ...

Introduction Western blotting also called immunoblotting is a widely used and accepted techniqueto detect levels of protein expression in a cell or tissue extract. This technique measures ...

相关专题 印迹(blotting)是生物学实验中常用的检测和分析方法。印迹(blotting)实验的过程可以简单描述为将待检测的生物大分子经电泳等方法分离后转移并固定在膜(如：硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜)上，然后用特异性识别物质(如探针)去识别，最后经显色反应(同位素放射自显影、荧光、化学发光等)在膜上显示出结果------印迹。 最 ...

相关专题 Northern 杂交(Northern blotting)　　 1979年，J.C.Alwine等提出：将电泳凝胶中的RNA转移到叠氮化的或其他化学修饰的活性滤纸上，通过共价交联作用使它们结合，因其方法同Southern杂交十分相似，故称之为Northern杂交。　　 1 原理　　 Northern杂交是利用DNA可以与RNA进 ...

相关专题 Western Blot技术专题 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学 ...

相关专题 Northern Blot I. Electrophoresis clean gel box with NaOH and/or SDS 2 hours to overnight rinse with water prepare Agarose gel solution 1 x MOPS H2O to 95 % of endv ...

相关专题 Western Blot技术专题 一.实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15000转/分1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 ...

相关专题 Western Blot技术专题 1.制胶及上样： (1)配制12%SDS-Page分离胶，混匀后注入边条厚度为2mm的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层异丙醇，室温下静置至凝固。 (2)待分离胶完全聚合后，倾去其上的水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓缓加入浓缩胶，使其充满加样梳间的空隙，室温下静置。待胶完全聚合。 ...

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相关专题 1.确定抗生素作用的最佳浓度：不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。 ① 提前24 小时在96 孔板或24 孔板中接种细胞8 孔，接种量以第二天长成25%单层为宜，置CO2 孵箱中37℃培养过夜。 ② 将培养液换成含抗生素的培养基， 抗生素浓度按梯度递增0(50 10 ...