• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        western操作步骤

        互联网

        2267
        相关专题
        Western Blot技术专题

        1.制胶及上样:

        (1)配制12%SDS-Page 分离胶,混匀后注入边条厚度为2mm的两块洁净玻璃板间,其上加一薄层异丙醇,室温下静置至凝固。

        (2)待分离胶完全聚合后,倾去其上的水层,以吸水纸吸净残余液体,插入加样梳,缓缓加入浓缩胶,使其充满加样梳间的空隙,室温下静置。待胶完全聚合。

        (3)将凝胶固定于电泳装置上,上、下槽加入电泳缓冲液。

        (4)小心拔去加样梳,使加样孔竖直,以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。

        (5)分别取50µg蛋白量的细胞总蛋白样品及蛋白质分子 量Marker,按4:1体积比加入5´样品缓冲液,以1´样品缓冲液?配平上样体积(总体积20µ1)后,于沸水浴中煮3min使蛋白变性。

        (6)将处理好的样品按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中。

        2.电泳

        (1)接通凝胶电泳仪 的电源,初始电压70V。(约30分钟)

        (2)溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V,继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。(约60分钟)

        3.转膜

        (1)从玻璃板中取出凝胶,将其浸泡于转移缓冲液中。

        (2)取与胶同样大小的硝酸纤维素膜,以95%乙醇浸泡5秒钟后浸泡于转移缓冲液5分钟以上待用。

        (3)按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵,保证每层之间没有气泡。

        (4)将转移夹放入转移槽,膜在正极、胶在负极,接冷却循环水,90V稳压转移2小时。

        4.染色

        (1)将硝酸纤维素浸入丽春红使用液中,振摇染色5-10min。

        (2)蛋白质条带出现后,用去离子水洗去硝酸纤维膜上的丽春红底色。

        (3)按照蛋白质分子量Marker指示的位置剪下目的条带所在的硝酸纤维素膜。

        5.封闭

        把硝酸纤维素膜浸入5%脱脂奶粉,室温摇动2小时。

        6.洗膜与杂交

        (1)以T-TBS洗膜,10分钟´ 3次。

        (2)第一抗体封闭: SPARC单抗以T-TBS 1:200稀释,按0.1ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中,去除所有气泡,4℃振摇过夜。

        -------------------------------------------------------------------------------------------------------

        (3)以T-TBS洗膜,10分钟´ 3次。

        (4)第二抗体封闭:辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体(1:4000),按0.1 ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中,去除所有气泡,室温下振摇60分钟。

        (5)以T-TBS洗膜,10分钟´ 3次。

        7.化学发光与曝光

        (1)将化学发光试剂盒中的两种试剂各取0.5ml,按1:1的比例混合,在暗室中与硝酸纤维素膜摇动孵育1分钟。

        (2)用滤纸沾干膜上的液体,用保鲜膜包好,用感光胶片在压片盒中曝光约1分钟。

        (3)曝光后的感光胶片在显影液中显影约30秒钟,定影液中定影1分钟,用水冲洗后晾干。

        (4)根据曝光情况调整曝光时间,重复压片、显影及定影,选择满意的胶片。

        (5)重复实验三次。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序