蛋白分离纯化

推荐书籍：《蛋白纯化与实验鉴定指南》、《生物工程下游技术》、《酶工程》、《酶制剂工业》 1)我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。 请问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用GST做亲和层析，但效率只有50～60%左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这 ...

在电泳开始的时候，SDS-PAGE 利用不连续系统，在浓缩胶中浓缩或"堆积"样品，使其成为一条非常锐利的区带。在不连续缓冲系统中，最初胶中的阴离子不同于（或不连续）电泳缓冲液中开始时的阴离子。NuPAGE?系统（Bis-Tris和Tris-Acetate）和Laemmli(Tris-Glycine)系统二者均为不连续系统的例证，以相同的方式起作用。但是，作为NuPAGE?系统中 ...

解离/非解离native缓冲液系统 很多应用蛋白质聚丙烯酰胺凝胶区带电泳（zone electrophoresis）的研究使用一种缓冲液系统，该系统的设计把所有的蛋白质分解成单一多肽亚单位。最常用的解离试剂是十二烷基硫酸钠（SDS）一种离子型去污剂，它通过包围在多肽骨架的周围变性蛋白质。在包含有过量的SDS和巯基试剂的蛋白质样品，100℃加热时，二硫键被打开，蛋白质完全解离成它的亚单位。在这些情况 ...

分离时选择了合适的蛋白柱，有时往往不能成功地完成蛋白的分离，同一根蛋白分离柱在不同的使用者手中可能会有不同的柱寿命及分离效果，正确的使用蛋白柱和正确的日常维护是保证成功分离蛋白及延长柱寿命的关键。 不论使用什么类型的蛋白柱，首先必须对其填料的性能有基本了解。如该柱适用什么样的溶剂，什么类型的样品，流速及耐压范围等，GAT提供的各种类型的蛋白柱，在柱箱内均有详细的说明书，使用柱子前，务必要仔细阅读， ...

研究的最后还是要看基因表达产物无论是用于检测还是用于棉衣保护都需要将表达出的蛋白质分离和纯化然而蛋白质性质各异故纯化方法不同现共享一些基本的纯化方法以飨读者: 蛋白质的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物理化学和生物学性质，综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异，利用一种同时多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择蛋白质提纯的方法。 蛋白质在组织或 ...

一、凝胶过滤色谱： 一般来说，凝胶过滤色谱的结果好坏直接取决于凝胶柱的柱效（每米多少理论塔板数），而影响柱效的因素主要有： 1、凝胶本身性质： 每一种凝胶均有其合适的分离范围，应选择合适的凝胶进行分离。同样分离范围的凝胶颗粒越细的，柱效越高。 2、色谱柱装填的好坏： 凝胶过滤色谱柱装填完后，一般可以用丙酮（或NaCl）测定柱效和峰对称性，一般对于平均颗粒直径在30~34微米的Superose PG ...

一、融合表达蛋白的纯化： 融合表达蛋白可以在原目标分子之外带有GST肽段或（His）6肽段，从而使得可以分别用Glutathione Sepharose凝胶或Chelating Sepharose凝胶进行亲和色谱分子，一步可以达到~90%的纯度，经过特异蛋白酶切后，再进行离子交换及高分辨凝胶过滤一般便可以达到所需的纯度（95~99%）。 二、包含体表达蛋白的纯化： 在E.coli系统表达重组蛋白， ...

Downstream（下游）与上游相对的概念，一般而言，上游指基因克隆、细胞培养等目的产物表达工序，下游指从表达有目的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的目的产物的一系列步骤。美、日、欧等发达国家生物技术产品工业化的实践证明：生物技术产品的产业化高度依赖于基因工程下游工序技术及设备的进步。 一、纯化工艺常用衔接技术： 1、盐析。常采用硫酸铵、硫酸钠盐析，获得的盐析沉淀物在低温冰箱(<- ...

随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易lIl。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工 ...

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1.机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2.渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 ...

常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。 柱子可以分为：加压，常压，减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶 ...

狭义来讲，提取指制备物与细胞固体成分或其它结合成分的分离，由固相转入液相或从细胞内生理状态转入外界特定溶液环境的过程，即分离前期被提取物从破碎的细胞中释放出来的过程。如果被提取物程固相或与固体结合，提取时由固相转入液相，常称为固液萃取；如果被提取物已经呈液相存在，提取时由一液相转入转入另一互不相溶的液相，这种方法称为液液萃取。 广义来讲，提取又可称为抽提或萃取，贯穿在整个分离纯化过程中，如核酸制备 ...

一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。蛋白质提取液：300ml 4.11Mtris-HCl（pH8）45ml 4.2甘油 ...

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项 1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。 2 Sephadex LH20 的原理。 Seph ...

本文由生物秀根据华东理工大学生物工程学院的酶工程课件整理而成 一、实验流程 二、实验安排 第1次 菌体超声破壁、离心、包涵体复性、 装离子交换柱 第2次 测酶活、定蛋白离子交换层析 层析样品进行浓缩、透析 第3次 浓缩、透析前、后样品测活、定蛋白 装分子筛柱 第4次 分子筛层析，并对收集样品进行测活、定蛋白等 第5次 对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析，并绘出分离纯化表 三、实验操作 第1次： 菌 ...

Preparation of protein extracts for western blot 1.Grow cells to mid-log (OD600 less or equal to 1.0). 2.Harvest about 5 OD's of cells in a 13X100 glass dispo tube (Use new tubes.Can be up to about 6 ...

Materials Milipore filter type HA 0.45 micron Culture plates (Linbro model 76-033-05) Protein in DDW or HEPES buffer (10 mg/ml) Vacuum grease Syringe with 18 G needle Procedure 1.Millipore filter a ...

一、试验目的 了解并掌握垂直板凝胶电泳的使用方法。 二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳是以聚丙烯酰胺凝胶做支持物的一种区带电泳，由于此种凝胶具有分子筛的性质，所以本法对样品的分离作用，不仅决定于样品中各组分所带净电荷的多少，也与分子的大小有关。其次，聚丙烯酰胺凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH 梯度的作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。 聚丙烯酰胺 ...

一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。　　2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3～4小时）。　　3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃。　　4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml　　1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml　　2、 ...

Comments: T antigen (131-259)is an MBP-Hisx6-fusion protein constructed by Laura Mizoue (refer to the wisdom page for details on the construct). i.Pick a single colony from freshly transformed cells ( ...