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        蛋白质提取的方法总汇

        互联网

        4471

        一、植物组织蛋白质提取方法

        1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液,可根据材料不同适当加入),准备提取液放在冰上。

        2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置(3~4小时)。

        3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃。

        4、提取上清夜,样品制备完成。

        蛋白质提取液:300ml

        1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml

        2、甘油(Glycerol)75ml

        3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g

        这种方法针对SDS-PAGE,垂直板电泳!

        二、植物组织蛋白质提取方法

        三氯醋酸-丙酮沉淀法

        1、在液氮中研磨叶片。

        2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。

        3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时),然后真空干燥沉淀,备用。

        4、上样前加入裂解液,室温放置30分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃待用。

        5、用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用。

        药品:

        提取液:含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮

        裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入1M的DTT65ul/ml。

        这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少!

        三、组织:肠黏膜

        目的:WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达

        应用TRIPURE提取蛋白质步骤:

        含蛋白质上清液中加入异丙醇:(1.5ml每1mlTRIPURE用量)

        倒转混匀,置室温10min

        离心:12000g,10min,4度,弃上清

        加入0.3M盐酸胍/95%乙醇:(2ml每1mlTRIPURE用量)

        振荡,置室温20min

        离心:7500g,5 min,4度,弃上清

        重复0.3M盐酸胍/95%乙醇步2次

        沉淀中加入100%乙醇 2ml

        充分振荡混匀,置室温20min

        离心:7500g,5min,4度,弃上清吹干沉

        1%SDS溶解沉淀

        离心:10000g,10min,4度

        取上清-20度保存(或可直接用于WESTERN BLOT)


        存在的问题:加入1%SDS后沉淀不溶解,还是很大的一块,4度离心后又多了白色沉定,SDS结晶测浓度,含量才1mg/ml左右。

        解决:提蛋白试剂盒,另外组织大小适中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮5~10分钟,效果很好的。

        四、植物材料:水稻苗,叶鞘,根

        1、200毫克样品置于冰上磨碎
          2、加lysis buffer,离心,10000rpm,4度,5min取上清
          3、重复离心5min
          lysis buffer:urea np-40  ampholine 2-me  pvp-40

        五、蛋白质样品制备

        秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进行。

        100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml10% 三氯乙酸(丙酮配制,含10mM即0.07%β-巯基乙醇),混匀,-20℃沉淀1小时,4℃,15000r/min离心15min,弃上清,沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巯基乙醇),再于-20℃沉淀1小时,同上离心弃上清,(有必要再用80%丙酮(含10mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
        按每mg干粉加入20μl(可调)UKS液[9.5 M尿素,5mM碳酸钾,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫苏糖醇),2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5~10),6% Triton X-100],37℃温育30min,期间搅动几次,28度(温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰)16000r/min离心15min,离心力越大时间长一点越好!上清即可上样电泳。或者-70度保存。

        六、植物根中蛋白质的抽取

        (1) sample,液氮研磨
          (2) 装1.5ml centrifuge 用tube
          (3) 加1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul
          (4) 12000rpm,4度,10~15minite
          (5) 取上层液,蛋白质就在里面。

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