蛋白表达

跨膜蛋白及药物研发跨膜蛋白作为细胞膜的重要组成部分, 在物质运输、信号转导和细胞间识别等多种细胞功能中发挥着重要作用。其功能异常往往会导致疾病的发生，这使它们成为理想的药物作用靶点。目前以跨膜蛋白为药物靶点占现阶段己知药物靶点的60%以上。而针对抗体药靶点，膜蛋白几乎占90%以上。跨膜蛋白在物质运输、信号转导和细胞间识别等多种细胞功能中发挥重要作用抗原制备尽管有着重大的意义，针对跨膜蛋白的药物开发仍然具有很大的挑 ...

先来看下传统重组蛋白表达系统：传统重组蛋白表达系统应对的挑战：操作流程长：5天-4周时间很多蛋白不能在细胞内成功表达不可以改造目标蛋白以大肠杆菌为代表的原核蛋白表达系统是常用的表达系统，具有表达量高和成本低的优点，但是蛋白质翻译后缺乏加工机制（比如形成二硫键和蛋白糖基化等），且很难保留生物活性。以甲醇毕赤酵母为代表的酵母蛋白表达系统，具有表达量高，可诱导，糖基化机制接近真核生物等优点，但是部分蛋白产品易降解，表 ...

免疫组化实验步骤试剂： PV-9000 通用二步法试剂盒 （北京中杉金桥）ZLI-9018 DAB显色试剂盒 （北京中杉金桥）脱蜡至水二甲苯Ⅰ(8min)二甲苯Ⅱ(8min)无水乙醇和二甲苯1:1(5min)无水乙醇(3min)95%乙醇(3min)85%乙醇(3min)75%乙醇(3min)PBS洗3遍二．抗原修复抗原修复液柠檬酸钠0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）PH值6.0。抗原修复100℃ 20min ;自然冷却至室温。三 ...

义翘神州日前曾邀请杨嘉慧博士进行了一场题为「获得高品质重组蛋白实验方案以及经典案例分析」技术公开课，课后收到了很多专业的提问，现将相关的问答简单列举一些，希望能够帮助更多的人获得高质量的重组蛋白。1. 是不是质粒片段越大转染效率越低?解答：一般情况是这样的，质粒片段越大，转染效率越低，但这也与表达宿主有关，不能一概而论。所以有时在进行表达载体优化时，会将质粒的片段或非重要功能区的一些片段进行删减，可以获得较好的转染效 ...

表达载体的构建是生物技术和所需蛋白质产生的基本工具，本文总结了pET-32α（+）载体技术的构建，该技术通常用于研究实验室。该方法包括获得用于构建载体的外源DNA片段，将DNA片段亚克隆到pET-32α（+）表达载体中，在大肠杆菌 BL21（DE3）中进行蛋白质表达以及在大肠杆菌中在天然条件下进行蛋白质纯化。裂解液。介绍作为分子生物学实验室中非常有用的实践，重组DNA技术（或基因克隆）是指将DNA片段从一种生物体转移到自 ...

WB 是实验室常见实验之一，蛋白定量后，上样之前，还需要哪些步骤制样呢？1. 蛋白含量测定后，Invent 建议大家把各个样品稀释到某一固定浓度（稀释可使用 PBS，水或裂解液），等体积等质量上样，计算上样体积时需包含 loading buffer 的体积。例如：把所有蛋白浓度都稀释到 2ug/ul，然后与 2Xloading buffer 1:1 混合后，浓度成为 1ug/ul，建议上样 20-30ul 即可。2. 与 loading buffer 混匀后，要将样品在沸水中煮 3-5 分钟，使蛋白充分 ...

丽春红（Ponceau S）染色是 WB 实验中的一个重要环节，今天就来给大家详解丽春红染色的作用和操作方法。丽春红染色作用可用于 PVDF 膜，硝酸纤维素膜和和醋酸纤维素膜上的蛋白的检测。丽春红染色原理丽春红带负电荷，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色的条带。丽春红特性丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用蒸馏水，PBS 或其它适当溶液洗去。为什么要用丽春红染色？通过丽春红染色可验 ...

人体的胰腺并非仅在进餐时脉冲式分泌胰岛素，而且是全天保持着相对平稳的的工作状态，这种持续、非进餐时的胰岛素分泌被称为基础胰岛素，对稳定血糖意义重大。每日基础和餐时血糖和胰岛素水平变化的曲线如下图：我们可以清晰地看到，血液中的胰岛素（蓝色实线）含量并非一根一直保持不动的直线，而是在三餐前后有着明显的增加。实际上，胰岛素水平灵敏的响应着体内血糖水平的变化（红色实线），从而能够在饭前饭后协助血糖水平的稳定。在这种灵敏响 ...

样品：重组胰蛋白酶，比活 4000USP u/mg pro.，上海雅心生物技术有限公司，纯度如图 1 所示。BAEE，Sigma.图 1. 重组胰蛋白酶的纯度的 SDS-PAGE 鉴定1. 最适温度的研究将底物 BAEE（0.25 mM）分别置于 4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 和 70℃ 水浴中温浴 20 min，加入相同体积的 RPT 酶液测定 rPT 的活力，结果表示为测定数值占最高酶活的百分比。2. 温度稳定性的研究 取 10 mg/ml RPT 纯酶液稀释 10 倍后，分别置于 4℃、15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60 ...

样品：重组胰蛋白酶，比活 4500USP u/mg pro.，上海雅心生物技术有限公司，纯度如图 1 所示。BAEE，Sigma.图 1. 重组胰蛋白酶的纯度的 SDS-PAGE 鉴定1. 最适 pH 的研究准备 pH 为 3~12 的底物 BAEE（0.25 mM），分别测定 rPT 纯酶液的活性，最后结果表示为测定数值占最高酶活的百分比。缓冲液成分依次为 25 mM NaAc-HAc (pH 3~6)，25 mM Tris-HCl (pH 7~8)，25 mM Gly-NaOH(pH 9~12)，所有缓冲液均为 25℃ 下配制。底物在 25℃ 温浴 10 分钟后，开始测活。2. pH 稳 ...

1、pH 稳定性将 rCPB 纯化后的酶液稀释至不同 pH 的 50 mM 缓冲液中 pH 分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0，使酶液的终浓度为 1 mg/mL，25℃ 孵育 12 h 后测活。图 1 rCPB 酶液的 pH 稳定性2、最适 pH测定 rCPB 纯酶液浓度为 1 mg/mL, 在不同 pH 条件下的催化速率，底物浓度为 0.1 mM/L，pH 分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、7.65、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0，pH3.0-5.0 用 50 mMNaAc-H ...

一、试剂准备1、Cas9 过表达慢病毒载体选择。 货号名称CR2001pLV-Cas9-PuroCR2002pLV-Cas9-NeoCR2003pLV-Cas9Nick-PuroCR2004pLV-Cas9Nick-Neo 我们现提供 4 种表达 Cas9 蛋白的慢病毒载体，您可以根据抗生素要求和基因敲除实验设计进行选择。1）抗生素选择：Puromycin 或 G418用嘌呤霉素筛选比较快，仅需 4-7 天即筛选出阳性细胞。G418 筛选需要 7-14 天左右。此外不同的 ...

xiayuxue 请教大家：我检测的是两种细胞(一种是正常细胞，一种是肿瘤细胞）中某个分子的表达，PCR检测的基因表达量一样多，而蛋白水平却不一样多，有这种可能吗？就是检测的本底表达，未加处理因素xiayuxue 没有人知道吗？bigbang_0_0 完全有这种可能，mRNA的量的改变不能代表蛋白的量的改变，从mRNA到蛋白，还涉及到翻译和翻译后修饰（包括决定蛋白质稳定性的翻译后修饰）等过程，而这些过程在癌变细胞中都是有可能发 ...

suiyuanjiuzhu 转染的话不就改变了细胞本来的表达量了吗xujian2004265 你不是要检测你的外源基因的表达吗？加我QQ24289096suiyuanjiuzhu 老板一定要我做蛋白 把mRNA让另一个人做了郁闷啊本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：shixiongcoming

0534130323 请求高手：实验中细胞受刺激之后一些相关细胞因子分泌增多，我用药物处理之后这些细胞因子分泌减少了。我往上追溯其作用机制，分别检测相关调控基因的蛋白表达和mRNA表达情况。结果发现药物只影响基因的蛋白表达，对其mRNA却没有影响。请问这该如何解释？霍一刀hxs 影响翻译而不影响转录，很正常的调控方式。0534130323 非常感谢whatisever 也可能只影响蛋白的稳定性。济南基美 降解被抑制了本文由丁香 ...

taohill 最近需要做过表达，有以下几个问题：1 克隆CDS,还是cDNA?2 该蛋白有两个剪切体，选那个呢？3 哪个数据库有蛋白表达谱？谢谢woxingwosu 你的概念比较模糊：1：克隆的时候当然是逆转录形成CDNA后去PCR克隆2：选哪个剪切体要看你的实验目的，是做一个还是两个都做3：看看www.genecards.com和http://www.wikigenes.org有没有蛋白表达谱了taohill thanks!taohill ...

naj2007 请教一下各位老师，在构建过表达载体的时候，VEGF和GFP是不是不可以做成融合蛋白，但是如果用不同的启动子的话，很容易丢失荧光，有没有什么解决方法。zhujoker 可以做成融合蛋白的，即使是使用不同的启动子的话荧光也不那么容易丢失的，大不了你将荧光的启动子换成强的如CMV，EF1a之类。kinguangjun 或者你可以用CMV-VEGF-IRES-GFP来做也可以，这样用一个启动子CMV同时表达两个蛋白 ...

dmdfe 本人将GFP基因后面加了一段大约110bp的序列，插入PET28A的BamH1和Hind3位点，最后在BL21中表达。经SDS-PAGE验证表明：目的蛋白 大量存在菌体裂解后沉淀即包涵体中，但是该沉淀无色。少量存在于上清中，上清显微弱的绿色。看文献大量报道GFP融合蛋白几乎都形成可溶性表达，目的蛋白在上清中，并且诱导条件没有太大要求。想请教一下各位做过GFP原核表达的经验，本人应该怎么改进条件（本人用37度 ...

birkin 我在尝试转染某种细胞，载体是购买的商业载体（pCMV6)，之前转染HEK293作为预实验，已经用WB证明有效，但是换到现在这种细胞之后就很奇怪，一开始想用短期转，结果WB做不出来，觉得可能是转染率太低，于是又改做稳定转染，用了G418筛选。花了近2个月，细胞稳定下来了，取样做RT-PCR，有相当强的mRNA表达（-RT和对照组转染也做了的，基本没有带，所以不会是污染），谁知做WB还是一点东西都没有……我都快疯了 ...

zuoliping 急切求助：因为有在文献查到PIK3/AKT与我要做的一个蛋白的表达有关，我想做这个通路的抑制剂与这个蛋白的表达的关系，看是否有时间和剂量的依赖性。但是抑制剂的说明说对这个剂量的范围很大，有查文献，在不同细胞中取的浓度组都不太一样，我想知道这些不同的浓度组是怎么确定的呢？要做MTT吗？希望大家不吝赐教！不甚感激！happytears 当然要做多次预实验了，做之前你需要大量阅读文献，看别人做过的你这种细 ...