PCR扩增

本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI， ...

1.问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。可能原因： 1）RNA被降解 (如何确定RNA是否被讲解，详见前“植物RNA的提取”。)建议解决方法： 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA； 在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA； 如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或 ...

把设计引物如何设计酶切位点这方面的帖子整理一下，因为昨天一下子看到三个相似问题。原帖如下：我想向你求教一个问题假如说我想把胰岛素基因和腺病毒载体连接起来如何确定设计目的基因PCR时的引物呢?和相应的限制性核酸内切酶呢?谢谢老师能给予讲解谢谢 ：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切 ...

引物合成介绍1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪，合成长链主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成仪，引物修饰和高OD数合成采用AB ...

Rt-PCR实验步骤一、实验器具与材料：1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸头：1ml、200μl、20μl3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量 ...

PCR目录 PCR原理 PCR反应体系与反应条件 PCR步骤 PCR检测 PCR反应特点 PCR仪器 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可

什么是miRNAMicroRNAs (miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNAs）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4 和 ...

变性梯度凝胶电泳DGGE操作步骤：1、将海绵垫固定在制胶架上，把类似‘三明治’结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。2、共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm，短的那根长9cm。将短的那根与Y形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在3、在两个注射器上分别标记‘高浓度’与‘低浓度’，并安装上相关的配件，调整梯度传送系 ...

载体操作中最常用的几个概念：1. The lac Z gene may be used as a simple "reporter" gene separated from its natural promoter. For example we might put the lac Z gene in front of a mammalian promoter transfect the DNA ...

1、 在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。2、 回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10　，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp ...

用于基因工程的工具酶 一限制性内切酶(Endonucleosase) (一)限制性内切酶(Endonucleosase)的发现与分类 1) 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断从而保证其不为外来噬菌体所感染而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护这种现象叫做限制-修饰它们由三个基因位点所控制:hsd R hsd M hsd S 十年后人们搞清了细菌的限制与修饰分 ...

材料、设备及试剂 　　一、材料 　　不同来源的模板DNA。 　　二、设备 　　移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪(PE公司)，台式高速离心机。 　　三、试剂： 　　1、10×PCR反应缓冲液：500mmol/L KCl 100mmol/L Tris?Cl 在25℃下 pH9.0 1.0％ Triton X-100。　　2、MgCl2 ：25mmol/L。 　　3、4种dNTP混合物:每 ...

1、双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer，如在TaKaRa公司的目录，就提供了很好的Buffer参照表，比如Sac Ⅱ和Hind Ⅲ就没有通用Buffer，但是，可以用T+BSA来酶切，而且效率还可以；如 ...

(adapted from Bruce A. Roe Department of Chemistry and Biochemistry The University of Oklahoma Norman Oklahoma 73019 broe@ou.edu)After an aliquot of the PCR mixture is analyzed on an agarose gel the r ...

张驰宇1 2) 　张高红1 2) 　杨　敏1) 　贲昆龙1) 3(1) 中国科学院昆明动物研究所分子与细胞免疫学实验室昆明　650223 ;2) 中国科学院研究生院北京　100039)摘要　为建立一种新的SYBR green Ⅰ实时定量RT-PCR 方法使之能够有效消除引物二聚体(PDs)对实时定量结果的影响. 对RT-PCR 特异性扩增产物和PDs 分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析. ...

一种新颖简便的荧光实时 RT-PCR相对定量方法的建立 A Novel and Convenient Relative Quantitative Method of Fluorescence Real Time RT-PCR Assay Based on Slope of Standard Curve 稿件编号：2005-0257 中文关键词：荧光实时定量 RT-PCR ，相对定量，绝对定量，标准 ...

A frequent cause of concern among investigators performing quantitative RT-PCR is inaccurate data due to DNA contamination in RNA preparations. Although DNA contamination is easily detected by perform ...

记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。愣是写了一大段的PCR条件摸索的讨论。后来PCR成为实验最基本的一步了，但是发现在PCR中还是有许多需要注意的地方。PCR的第一步就是引物设计了。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常 ...

一、免疫PCR要点（1）连接分子免疫PCR需要适当的连接分子连接报告分子和抗原抗体复合物。1 992年Sano用重组的链亲和素-蛋白A嵌合体作为连接分子，创立了免疫PCR技术。该融合蛋白的蛋白A可结合抗体的Fc段，链亲和素可结合DNA分子上的生物素，Sano利用此连接分子把一段生物素化的DNA（PUC19质粒DNA）连接到固定在酶标板上的抗原抗体复合物上，成功的检测到了牛血清蛋白，比传统ELISA ...

前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了 很多次，不过很快改善了 实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHIHindIII提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用B ...