PCR运用

Labonchip的PCR个人体会PCR应该是分子生物学的基本，记得刚进实验室时，大家的口头禅就是：今天你P了吗?那怎样才能做好PCR，结合个人体会，我谈谈自己的看法。论坛里高人很多，说得不对的还请多多指教和包含。当然，若能给新人朋友们带去一些帮助，那我本贴的目的就算是达到了。PCR设计的一般套路1） 目的基因或目的基因片段对象是什么？对于原核生物来说，由于不存在外显子和内含子，因此还比较简单，直接从genebank ...

欲通过RT-PCR检测一种基因的不同剪接异构体表达情况，在文献(cancer research, oncogene)中查到的两对引物序列如下：P1 5' atg agg atc cca tgg gcc agc a 3'P2 5' aag ggc ttt tca ctt gtt tta c 3'P1 5' atg agg atc cca tgg gcc agc a 3'P3 5' aag ggc ttt tca cct gta tga g 3'RT用的是MBI的试剂盒,反应体系20ul：总RNA 4.0 ug, oligo 1 ul,M-Mulv 1 ul,反应条件为70℃5分钟,37℃5分钟,42℃60分钟,70℃1 ...

我要得到的目的片段的序列如下：1: BD073420. Utilization of tr...OCUS BD073420 1266 bp DNA linear PAT 27-AUG-2002DEFINITION Utilization of transcription factor Brn-3a.ACCESSION BD073420VERSION BD073420.1 GI:22619023KEYWORDS JP 2001511344-A/2.SOURCE Mus musculus (house mouse) ...

pcr产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　pcr反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④pcr循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引 ...

PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时 ...

PCR的假阳性问题深受重视，但我个人认为PCR假阴性问题相对于临床检测更为严重。其实PCR假阳性的问题是比较单纯的，一般仅涉及污染和引物的非特异性问题。而污染可以通过严格的实验室管理，合理的环境设置，以及加入UNG酶抗污染基本可以解决，而引物的非特异性问题基本属于厂家试剂质量问题。而PCR的假阴性却不同，它涉及了与PCR实验的几乎所有人员和技术环节，十分复杂。就临床而言，大三阳检出率低、甚至于GC镜下都很多时， ...

PCR的优化在PCR的优化开始阶段，应用新的DNA模板，引物或热稳定DNA聚合酶等材料建立的PCR方法，其扩增效果一般总不是最佳的。这种PCR反应通常要求尽量抑制非特异性扩增和（或）增加目的DNA产物的产率。表1列举了一些通常遇到的问题和对PCR反应进行优化的一些推荐方法。表1 PCR扩增的疑难解析问题解释补救措施目的产物条带在两种阳性对照管与试验管内部呈现明显的非常模糊的带型。目的产物条带有时呈不清晰的成片 ...

PCR优化在PCR的优化开始阶段，应用新的DNA模板，引物或热稳定DNA聚合酶等材料建立的PCR方法，其扩增效果一般总不是最佳的。这种PCR反应通常要求尽量抑制非特异性扩增和（或）增加目的DNA产物的产率。表1列举了一些通常遇到的问题和对PCR反应进行优化的一些推荐方法。表1 PCR扩增的疑难解析问题 解释 补救措施目的产物条带在两种阳性对照管与试验管内部呈现明显的非常模糊的带型。目的产物条带有时呈不清晰的成片条带，条 ...

PCR反应程序的优化1二价阳离子。在使用没有加Mg2+反应液时，应注意一定要外加一定浓度的镁离子。大量.二价镁离子与dNTP和模板〔磷酸二酯键骨架上的负电荷)结合，从而大大提高了反应的效率和特异性。2引物。PCR所需的引物终浓度一般为0.1~1.0µmol/L，使用更高浓度的引物将使所得的产物量急剧减少。如果新合成的引物在退火温度接近Tm值的情况下没有产物生成，就降低退火温度再进行反应;如果这样仍旧不能反应，则应马 ...

初来乍到，我刚查到的一篇文章。希望对大家有点帮助！怎样选出最合适的Taq酶随着分子生物学研究发展的不断广泛和深入，PCR已成为一门相当成熟的常规技术，而热聚合酶（即Taq酶）的合理选择是PCR成败与否的一个关键因素。目前市面上有多种Taq酶，能够满足多方面的实验需要。那么，如何选择最合适的Taq酶？根据用户经常考虑的指标，如特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等，我 ...

我想请教大家：我的PCR跑出四条带，亮度不相上下，包括目的基因，其余杂带比目的带短，退火温度52-58都试过，没改善。接着调高退火温度有可能得到特异条带吗？会不会引物设计有问题？我用的是PRIMER DESIGNER 1.01.烦劳看看我的基因序列，引物，要真有问题，就死心塌地重订引物了。1 cggcagcagc gggaggcgag gggcgccacc gaggagccga gcccgccgag ccgggcgctc61 tatttcagcg gg ...

多少同学能将 RT-PCR、Realtime-PCR、QPCR区分清楚？有多少同学还在犯晕？今儿这贴，师兄就带你区分区分，人家破除迷信，咱就来个破除 PCR 迷雾。什么是 RT-PCR？逆转录PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通 ...

去年我一直在跟qPCR、逆转录和SYBRGreen QPCR反应做斗争，其中遇到了不少困难，现在已经告别当初的迷茫。当时在我艰难摸索的时候就想，等我都学会了，我一定要写篇帖子，把当初遇到的一些困难和最后是如何解决这些问题的，写出来，一来可以帮助更多像我这样的人，二来也算让自己有点成就感了。其中有一次，RNA提取好了，跑完胶3条带非常漂亮，测了浓度有500ng/ul呢，做完逆转录，满怀信心的做QPCR反应，做完发现Ct值 ...

问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间

Cell Signaling Technology(CST)7月29日宣布，将关于使用PCR（即聚合酶链式反应）检测ALK基因重排的专利权的全球非独占性许可授予Cepheid公司。Cepheid公司将开发一种诊断试剂，用于鉴定ALK基因重排型非小细胞肺癌(NSCLC)患者。 肺癌是全世界癌症死亡的首因，每年有超过180万个新病例被确诊，其中大约85%是非小细胞肺癌。由于此类患者通常 ...

PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多 ...

PCR技术通常是定性检测特定 RNA与DNA序列的常规方法。而现在，实时定量 PCR技术已经越来越成熟，在病原体检测领域中有突出的优势，并已在医疗诊断领域中崭露头角。实时定量PCR技术主要是利用标记有荧光染料的特异性探针，在PCR过程中与目标序列发生特异性结合并在Taq酶作用下发生水解，而使检测荧光的强度发生变化。这些变化将用于监测反应进程并估算模板量。 由于荧光探针的使用，使核酸 ...

多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种模拟天然DNA复制过程，在体外扩增特异性DNA（或RNA）片段的新技术。本实验是将待检双链DNA经94℃高温变性成单链作模板，然后加入一对人工合成的寡核苷酸引物，引物分别与待扩增DNA片段的两端互补，经55℃ 低温退火，引物与模板互补结合。在72℃条件下，结合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反应体系中的4种d ...

一．原理PCR产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。本实验中，Buffer PCR-A促使大于100bp的DNA片断选择性地吸附到silica膜上。经Buffer W1、Buffer W2洗涤去除残留在silica膜上的 ...

该讲座主要向我们展示PCR Array简单、准确的定量PCR分析技术。该技术非常适合生物通路和疾病研究；其性能优良，确保了灵敏性、特异性、稳定性和可靠性。从中可以学习到研究人员在癌症、免疫学和毒理学领域的基因表达、microRNA和表观遗传学工作中，是如何应用PCR Arrays。