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        PCR法检测乙肝病毒(HBV)

        互联网

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        多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种模拟天然DNA复制过程,在体外扩增特异性DNA(或RNA)片段的新技术。本实验是将待检双链DNA经94℃高温变性成单链作模板,然后加入一对人工合成的寡核苷酸引物,引物分别与待扩增DNA片段的两端互补,经55℃ 低温退火,引物与模板互补结合。

        在72℃条件下,结合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下,利用反应体系中的4种dNTP为原料,按碱基互补配对的方式延伸合成两条新的DNA链。所扩增的DNA可作为下一轮扩增反应的模板。重复上述循环过程,经过20~30个周期后,特异的目的DNA可扩增百万倍以上。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后即可观察到特异的扩增条带。

        PCR方法操作简便,灵敏度高,可检测出少至0.1pg的目的DNA。目前已广泛应用于多种病原微生物的检测。

        乙肝病毒(HBV)感染引起的乙型肝炎,在我国发病率很高,而且HBV与肝硬化、原发性肝癌关系密切,因此,HBV的诊断极为重要。PCR检测HBV-DNA敏感性明显高于传统的血清学方法,且能显示HBV在体内复制情况,直接反映患者血液的感染性,并对模棱两可的或与临床表现不符的血清学结果,PCR技术有助于明确诊断。

        【材料】

        待检血清、HBV-PCR反应液 20管(20μl/ 管)、HBV-DNA裂解液、阳性模板、溴化乙锭、PCR扩增仪、电泳仪、紫外线分析仪。

        【方法】

        1、标本处理:

        取混匀的血清20μl加20μl裂解液,搅匀后100℃沸水浴10分钟,最后15000rpm/分钟离心3分钟,取4μl上清待检。

        2、加样及PCR:

        取反应液一管(使用前稍加离心),加4μl待检上清或阳性对照于底层反应液中,混匀后高速离心片刻,然后置94℃预变性2分钟,再按94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/60秒扩增35个循环。

        3、电泳与结果判断:

        取15μl 反应液,经2%琼脂糖凝胶电泳(5V/cm)30分钟后,在紫外灯下观察结果,若410bp处出现橙黄色带,则HBV为阳性。

        【注意事项】

        1、反应管中加好所有试剂后,应立即上机扩增,以免形成过多的二聚体。

        2、阳性模板可用阳性血清代替,处理方法同上。

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