Real-Time PCR

Joseph SambrookPeter Maccallum Cancer Institute and The University of Melbourne AustraliaDavid W. RussellUniversity of Texas Southwestern Medical Center DallasExcerpted From Molecular Cloning: A Labor ...

发布时间04年07月13日 11时13分 　 　　张 蓓 沈立松上海第二医科大学附属新华医院上海儿童医学中心实验诊断中心 多聚集链反应（polymerase chain reactionPCR）技术发明至今已近20年了，在这期间技术得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）技 ...

问：什么是QPCR？答：QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR。问：QPCR、DNA检测、PCR之间的关系？答：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction简称PCR）原理凭借敏感、特异、快速的特点荣获93年诺贝尔化学奖。因其在病 ...

一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引 ...

real-time PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程。

一 ：引物的设计引物的设计对于这个实验至关重要，因为real time pcr的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道，还有几点必须注意：1，引物的错配率（引物错配形成引物二聚体，但是SYBR照样能嵌入进去，结果导致实验结果的误差很大，重复性也不好）。2，引物的特异性一定要高（不像常规PCR，引物同源性不高，只要两条产物的片段长度相差足够大，在电泳的时候能够区 ...

实时定量PCR以其精确、快速、方便，越来越多的应用在科研、临床及检验检疫的各个领域。但是定量PCR是对精确性要求很高的实验，实验的条件对实验结果的影响非常大。在此谈谈体系优化的问题，希望对做相关试验研究的战友有所帮助1.基本参数的优化： 1）MgCl2的浓度：在PCR反应中，MgCl2的浓度对酶的活性是至关重要的，不仅如此，合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低的Cp(crossingpoin ...

方法简介所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。RT-qPCR是由 ...

这是讲实验中可能遇到的问题

一、实时荧光Taqman 探针设计 总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游 ...

一 引物的设计 引物的设计对于这个实验至关重要，因为real time pcr的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道，还有几点必须注意： 1，引物的错配率（引物错配形成引物二聚体，但是SYBR照样能嵌入进去，结果导致实验结果的误差很大，重复性也不好）。 2，引物的特异性一定要高（不像常规PCR，引物同源性不高，只要两条产物的片段长度相差足够大，在电泳的时候能 ...

由多个实验室参与、Roche赞助的、研究LigntCycler和ABI PRISM real-time PCR仪性能对比的论文，发表在2004年Clinical Chemistry上（2004;50:1088-1092），SCI IF 5.454 点击下载 ...

High-throughput SNP genotyping by single-tube PCR with Tm-shift primers. Wang J Chuang K Ahluwalia M Patel S Umblas N Mirel D Higuchi R Germer S. Human Genetics Department Roche Molecular Systems Alam ...

1. SG浓度：　　终浓度1:5000－1:100000，一般为1:10000—1:70000 2. Primer浓度：　　终浓度50nM－300nM　　固定摸板浓度的梯度实验　　不加摸板的对照实验（NTC）——有无非特异信号　　熔解曲线的分析——是否单峰　　建议使用HPLC纯化的引物 3. MgCl2浓度　　降低MgCl2浓度以减少非特 ...

realtime PCR 在PCR体系中加有sybr green或者探针，普通的RT-PCR则没有。 realtime PCR上机后从电脑上直接读出结果，普通的RT-PCR需要跑胶、紫外线下观察结果或用凝胶成像系统分析。 realtime PCR一次测多种mRNA表达需要多色荧光，这就需要仪器支持多色荧光并且探针用不同荧光标记。普通的RT-PCR，可以采取双重PCR的方法同时检测2种mRNA表达。 ...