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        real-time PCR技术的原理及应用

        互联网

        53641

        一、实时荧光定量PCR原理

        (一)定义:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。

        (二)实时原理

        1、常规PCR技术:

        对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测。

        2、实时定量PCR技术:

        利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析

        3、如何对起始模板定量?

        通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.

        4、几个概念:

        (1)扩增曲线 :

        (2) 荧光阈值:

        (3)Ct值:

        CT值的重现性:

        5、定量原理:

        理想的PCR反应: X=Xundefined2n

        非理想的PCR反应: X=X0 (1+Ex)n

        n:扩增反应的循环次数

        X:第n次循环后的产物量

        X0:初始模板量

        Ex:扩增效率

        5、标准曲线

        6、绝对定量

        1)确定未知样品的 C(t)值

        2)通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量


        二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍

        方法一:SYBR Green法

        (一)工作原理

        1、SYBR Green  能结合到双链DNA的小沟部位


        real-time PCR技术的原理及应用
            

         2、SYBR Green  只有和双链DNA结合后才发荧光

        3、变性时,DNA双链分开,无荧光

        4、复性和延伸时,形成双链DNA, SYBR Green 发荧光,在此阶段采集荧光信号。


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        PCR反应体系的建立及优化:

         1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性,太低,荧光信号太弱,不易检测
           2、Primer:引物的特异性高,否则扩增有杂带,定量不准
           3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物
          4、反应Buffer 体系的优化
          5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定
           6、其他与常规PCR相同

        (二)应用范围

        1、起始模板的测定;
          2、 基因型的分析;
          3、 融解曲线分析:可以优化PCR反应的条件,对常规PCR有指导意义,如对primer的评价;可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。

        (三)优点及缺点

        优点:对DNA模板没有选择性;适用于任何DNA; 使用方便;不必设计复杂探针;非常灵敏; 便宜。

         缺点:容易与非特异性双链DNA结合,产生假阳性;但可以通过融解曲线的分析,优化反应条件;   对引物特异性要求较高。


        方法二:TaqMan---水解型杂交探针


        real-time PCR技术的原理及应用

         *5′端标记有报告基团(Reporter, R)  ,如FAM、VIC等 
          *3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)
          *_探针完整,R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ,无荧光, R与Q分开,发荧光
          *Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性,可水解探针

        一)工作原理


        real-time PCR技术的原理及应用


        注意:每扩增一条DNA分子,释放一个荧光信号,可以在循环过程中任一点检测荧光

        PCR反应的建立:

        1、引物、探针的设计:

         探针Tm为68-70℃ ,<30 bp, 5’不能有G,G可能会淬灭荧光素,
          引物尽量靠近探针,扩增片段<400 bp,引物Tm为59-60℃

        2、反应参数的确定:

        一般为:94 ℃,10-20S
           60℃,30-60S(Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高)
           也可通过温度梯度优化退火温度72 ℃,45 S,

        3、优化引物和探针浓度:获得最小Ct值,信号/背景比值的最大值 
           引物浓度:50-900nM
           探针浓度:50-250nM

        4、其他与常规PCR相同

        (二)优缺点

        优点:
          对目标序列的高特异性
                  ------阴性结果确定
          设计相对简单
                 ------与目标序列某一区域互补
          重复性比较好

        缺点:
          只适合一个特定的目标;
          委托公司标记,价格较高;
          不易找到本底低的探针

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