Real-Time PCR

——从RNA提取到荧光定量PCR完美解决方案从RNA开始到基因定量PCR的研究，已经开始成为一条经典的实验流程，其在科研、临检、进出口检验、公安系统等多种领域的应用越来越广泛。不过由于RNA提取以及荧光定量PCR实验的灵敏度和特异性要求，使得这一实验方案在实验操作、实验设计以及实验数据分析方面，对于实验人员的要求越来越高。TIANGEN公司根据多年在这一领域的研发经验，给客户提供一套规范的“从RNA提取—RT— ...

问题可能原因建议解决方法定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量DNA模板质量不好，含有抑制剂提高模板质量，诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNAPCR引物设计较差避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。探针设计较差对探针序列进行blast比对，设计符合要求的探针PCR引物合成较差用普通电泳法，看引物的设 ...

实时荧光PCR作为新一代分子生物学研究工具，已成为分子诊断、临床检验以及基础生物医学研究的主流技术平台，广泛应用于传染病、肿瘤、遗传病、心血管等疾病的分子诊断。为使广大一线工作人员全面掌握该技术，本中心在连续举办四届荧光PCR研讨会并获广泛好评的基础上，再次携手国内外荧光PCR领域的知名专家，于2012年12月2-8日举办“第五届荧光PCR与分子诊断研讨会” 。本届研讨会将继续采用深受好评的技术讲座与现场实验相结 ...

N摘要：荧光条形码标记的单分子检测技术是一种全新的高通量检测基因表达谱、miRNA等分子的技术，其定量结果可与real-time PCR相媲美。由于它的高通量和高精确性填补了基因芯片和real-time PCR之间的技术空白，一经问世大受欢迎，其检测结果频频登载在nature、science、cell等顶级杂志上。NanoString公司研发的荧光条形码标记的单分子检测技术最早诞生于Leroy Hood博士创立的系统生 ...

使用Exicycler 96发表的文章Ref.#Reference1Dissection of the essential steps for condensin accumulation at kinetochores and rDNAs during fission yeast mitosisNorihiko Nakazawa, Takahiro Nakamura, Aya Kokubu, Masahiro Ebe, Koji Nagao and Mitsuhoro Yanagida.J Cell Biol. 2008 Mar 2 ...

厦门大学第二届“荧光PCR－基础与应用”研习班通知(2006年10月31－11月4日，厦门)荧光PCR技术在疾病的快速诊断、病原微生物的耐药检测和基因突变检测等领域发挥了重要的作用。为了使更多的检验人员或研究人员能够尽快掌握该技术，厦门大学分子诊断实验室将继续与国外著名科学家合作，举办第二届“荧光PCR－基础与应用”研习班。本届研习班将在成功举办第一届研习班并获得广泛好评的基础上，进一步优化完善培训课程内容，融入 ...

Stormstar Real Time PCR Master Mix SYBR GREENStormstar SybrGreen PCR Master Mix产品名称Stormstar SybrGreen qPCR Master Mix价 格说明书DBI-2143200 Reaction2400元DBI-21441000 Reaction11800元DBI-217340 Reaction500元●产品内容 名 称数 量Stormstar SybrGreen qPCR Master Mix1ml×5支●产品 ...

REAL-TIME 引物设计与是否跨内含子的检测方法1.园子里最详细的检测引物是否跨内含子的流程2.提供多图显示如何找到基因外显子与内含子3.如何最简便设计跨内含子的引物（利用primer-blast）感谢隔壁的山西人提出这个问题，以及丁香园，google，百度，PUBMED提供解决问题的方法和线索供我拼凑整理。问题一：如何在pubmed上找到目标基因的DNA序列以及其内含子和外显子情况。步骤：打开NCBI主页面，选 ...

实时定量PCR完全手册方法简介所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。RT-qPCR是由三个步骤组成:1. 反转录:依赖反转 ...

师兄有云： 话说，那张无忌在山谷里练了五年九阳神功，相当于读了一 PHD，后来又在明教暗道里搞了个post-doc，出道立马名动江湖，打的第一份工就是接管了一个破落实验室。接手实验室的第一天，无忌就发现手下小昭是个既有心机，又有城府的小姑娘，长得好看且不说，还有一身功夫，还精通八卦五行之术。但就是荧光定量 PCR 老是做不好。咋办捏？一天，无忌君找到小昭无忌曰：“小昭，你觉得现在做实验有什么困难么？”小昭曰：“无忌哥，我好多问题，就是不知 ...

qPCR的数据相对定量分析其实很简单。我做了很多的qPCR实验，也看了很多的资料，包括Nature protocol， AB官方的分析教程，MIQE，甚至包括一些商业化软件使用的教程及教程里面记述的原理。我在这里跟大家分享一下自己的经验，最常用，最普遍的相对定量方法就是2^-△△Ct法，该法最最简单的说就是：首先将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值，得到的数就是△Ct ...

1. 如果扩增曲线ct值比较靠后的话，32左右，一般有什么方法解决没有ct值比较靠后，对实验有一定的影响，因为经过那么多次的循环，酶的活性有可能有所下降，这时候扩增效率会有所改变（而定量PCR的理论基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值）。因此最好能够把ct值往前移。解决办法可以将模板加以浓缩或者抽干之后用少量水去溶解。2. 为什么合成的引物做不加摸板的对照也能扩增出目的条带，而内参用同样体系就没有呢?引物被 ...

1. 如果扩增曲线ct值比较靠后的话，32左右，一般有什么方法解决没有ct值比较靠后，对实验有一定的影响，因为经过那么多次的循环，酶的活性有可能有所下降，这时候扩增效率会有所改变（而定量PCR的理论基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值）。因此最好能够把ct值往前移。解决办法可以将模板加以浓缩或者抽干之后用少量水去溶解。2. 为什么合成的引物做不加摸板的对照也能扩增出目的条带，而内参用同样体系就没有呢?引物被 ...

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度 ...

qPCR的数据相对定量分析其实很简单。我做了很多的qPCR实验，也看了很多的资料，包括Nature protocol， AB官方的分析教程，MIQE，甚至包括一些商业化软件使用的教程及教程里面记述的原理。我在这里跟大家分享一下自己的经验，最常用，最普遍的相对定量方法就是2^-△△Ct法，该法最最简单的说就是：首先将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值，得到的数就是△Ct ...

基因表达的定义：每当说到基因表达，我自己都觉得不知所云，是指RNA，还是蛋白？是指mRNA还是包括风头正旺的非编码RNA？mRNA还有不翻译的RNA呢。应该说转录水平指的是RNA水平，而蛋白应该叫翻译水平？我们这里就特指编码蛋白的mRNA的量的检测。方法：很多很多，我们常用的也就是RT-PCR和northern（实际上我也只知道他们，丢人啊），但是RNA酶保护分析在国外很常用，也有半定量的功能，一次性试剂盒还能以此 ...

一、引物设计中的几个注意事项1、 引物设计最好用相关的软件来进行设计，考虑引物自身回折、错配、引物二聚体、复性温度、产物变性温度等问题，其中产物的变性温度是大家不太关心的问题，但有些产物在一般的95度条件下不能充分解链，会严重影响实验结果。2、 引物所设计的片断一定要有足够的特异性，选择好片段后，最好到互联网中进行相关的搜索，看在样本的基因组有没有相拟的基因以及假基因等，如果有，则可选择特异性更高的区域。3、 在进行mRNA表 ...

实时定量PCR (qPCR)的优势· 实时检测PCR反应过程· 精确计算出每个循环的PCR产物量· 扩增和检测同时进行· 消除后续PCR的干扰在实时定量PCR反应中，杂交探针与插入染料如SYBR Green相比是更好的选择。荧光标记探针可以提高实时定量PCR结果的效率、灵敏度和特异性。而且定量PCR可以在一个反应里同时检测多个目标基因。实时定量PCR的应用· 基因表达分析· 转基因检测和定量· 病原体检测和定量· 基因型/ SNP分析· 突变检测多重PCR分析 ...

北京协和医学院 阜外心血管病医院 心外科 心血管病国家重点实验室吴益和 实验中必须坚持的一些好习惯 1.加入试剂之前把它混匀一下以免放置时间长了浓度不均 2.移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性 3.所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因一、防止RNA酶污染的措施 一、防止RNA酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前 ...

PCR与定量PCR反应最大的魅力是扩增力能与高灵敏度，但易污染一直是困扰各实验室的大问题，极微量的污染就可能造成假阳性反应，破坏试验结果。如何监测与防止PCR污染，是现在各实验室的重要课题。一、污染监测一个好的PCR实验室，必须要时刻注意污染的监测，考虑是否受到污染，如有污染，是何原因造成的。通过有效地监测，采取正确的相应措施，防止或消除污染。对照试验是监测PCR污染的重要手段。1、阴性对照：阴性 ...