Real-Time PCR

Q1．CT值出现过晚1.扩增效率低，反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。3.PCR产物太长。一般采用80-150bp的产物长度。Q2．无CT值（信号）出现1.反应循环数不够。一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。2.检测荧光信号的步骤有误。一般SG ...

我正在做用SYBR GREEN I做荧光染料的实时定量PCR，遇到的问题不少，同时也有点心得，借些平台和各位站友交流，望各位给以指证和帮助。首先，主要的问题是反应效率低下：我用10-1 ～10-9 的浓度梯度的反转录产物作为模板，预设它们的浓度是1×10-1 ～10-9 ，结果作出的各个模板浓度对应的CT值与理论完全相反，即：浓度越小，反应曲线就越快地起峰，就是CT值越小。作溶解曲线有时单峰，有时是双峰。BIO-RAD的ICYCLER软件作 ...

RNA isolation and real-time quantitative RT-PCRTotal RNA was isolated from lung, kidney and spleen issue of Smad3-/- and WT mice with TRIzol reagent (Invitrogen, Gaithersburg, MD). For first-strand cDNA synthesis, 2.5 μg total RNA were dissolved in 25 μl DEPC-treated ddH2O. Five microliters of ...

前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，考虑到自己作荧光定量PCR工作已经了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。 普通PCR与荧光定量P ...

各位老师：您们好！偶欲做几个基因的RT-PCR实验。偶先用传统的半定量两步法RT-PCR试剂盒(TaKaRa DRR019A)扩增了几个基因，并用该试剂盒反转录了不少cDNA。但还有2个基因偶打算用real time PCR法来扩增。拟采用TaKaRa DRR041S试剂盒。但是TaKaRa DRR041S试剂盒说明书上写的反转录步骤是使用另外一个单独的RT Reagents (TaKaRa DRR033A)，得到cDNA再用TaKaRa DR ...

过去的几年里人群中肥胖症患者的比例急剧升高。因此对脂肪细胞---脂肪组织的基本组成单位---功能的研究也不断升温。这其中大多数的研究通过从脂肪组织中提取少量的RNA来检测参与代谢调控的低丰度基因表达水平。就小量RNA的检测而言，与传统的RNA定量检测手段（如RNA印迹分析）相比，逆转录实时定量PCR(qRT-PCR)更为灵敏。实际上，这一技术足以定量单细胞的RNA水平。qRT-PCR应用的主要限制因素是结果的高不稳定 ...

准备做Real time-PCR,目的基因序列（cDNA)和引物见下（PP5.0设计）我用Blast分析了一下，可是出来的结果不太懂，有哪位大虾解释一下及给出建议。谢谢！BLAST地址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi结果：见附图上游：CTCTGGCTGACTTGGCTTGG下游：GATTTGGTTGCTCTGTTGACTC原cDNA序列：atgaccgcgc ggggcgcc ...

Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB)—a practical epidemiological and diagnostic tool.Sequence-specific amplification polymorphisms (SSAPs): a multi-locus approach for analyzing transposon insertions.Single nucleotide poly ...

北大医学部的新英格兰医学发信站: BBS 水木清华站 (Wed Dec 15 15:51:58 2004), 站内基础医学院神经生物学系于常海教授所带领的课题组在SARS病毒早期检测方面取得突出进展，其研究成果近期发表于国际顶尖医学类杂志《新英格兰医学》（《NewEngland Journal of Medicine》）(2004, 350: 1577-1579)，论文题目为Boosting the sensitivity of real-time polymerase-chain-re ...

第二届"荧光PCR－基础与应用"研习班第一轮通知(2006年10月31－11月4日，厦门)荧光PCR技术在疾病的快速诊断、病原微生物的耐药检测和基因突变检测等领域发挥了重要的作用。为了使更多的检验人员或研究人员能够尽快掌握该技术，厦门大学分子诊断实验室将继续与国外著名科学家合作，举办第二届"荧光PCR－基础与应用"研习班。本届研习班将在成功举办第一届研习班并获得广泛好评的基础上，进一步优化完善培训课程内容，融入荧 ...

In September 1993 Higuchi et al. published a report in the journal Biotechnology (NY). Titled “Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions,” the paper described the technique that would come to be known as Real-Time PCR (for more info, click here). In the original re ...

实时定量PCR用于基因的定量分离——正在兴起的一项技术前言：目前许多关于定量PCR的实验报道证实了定量PCR由一门实验技术向科学研究的大的方向的转变。定量PCR有许多用途：测量mRNA表达的水平，DNA的拷贝数目，转基因的拷贝数目和表达分析，等位基因的鉴定和测量滤过性病毒的浓度测定。实时定量PCR的用途的应用范围非常广阔，而且它能够对菌种的增殖过程中低成本的反应器和反应物进行检测。成功的运用实时定量PCR并 ...

Real time PCR文献大全 这是目录，内容包括以下几类ReviewsBasics and Theory of real-time PCRClinical applicationsReverse Trascriptase PCRNormalizationSYBR GreenLightUp probesTaqman probesOther probing techniquesSingle-cell PCRImmuno-PCRMicroarrayReal-time PCR ...

1．我做的重复样品的标准曲线差别很大，这是什么原因？是不是CDNA样品不纯？答复：如果操作正确的话，重复样本是不应该差别很大的。做重复样本时，应当将所有的反应成分都先混合到同一反应管当中，然后再进行分装。这样可以最大限度地降低加样误差和样品混合不匀的问题。您可以尝试一下，如果还有问题的话，可以把结果文件直接MAIL给我们。以便我们可以更直观地了解问题。2．做realtime pcr的CDNA的浓度是多少？我看到有的文 ...

Applied Biosystems公司关于Real Time PCR的介绍，比较简单，但希望对新接触这个领域的朋友会有所帮助。Page 1 of 8Essentials of Real Time PCRAbout Real-Time PCR AssaysReal-time Polymerase Chain Reaction (PCR) is the ability to monitor the progress of the PCR asit occurs ( i.e., in real time). Data is therefore collected ...

实时荧光定量PCR——一种科学准确的定量方法实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。一. 实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 ...

miRNA实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR从1996年美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术以来，该技术已经越来越广泛的应用到各类RNA的研究中，成为研究RNA必不可少的实验手段之一。目前比较常用的方法有两种：（1）TaqMan荧光探针法：该方法在特异性探针的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，荧光基团发光被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，探针被降解 ...

基康生物TaqMan-MGB双标记荧光探针合成TaqMan-MGB 探针与传统的TaqMan-TAMRA探针比较具有以下优势：1. 提高TM值— 平均15bases可提高18℃，这样可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列设计有很大的帮助，并且提高配对与非配对模板间的TM值差异。2.提高信噪比— 由于在探针的3’端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基因在空间的位置更接近，实验结果更精确，分辨率更高。3. 更简化实验— MGB探针实 ...

在进行荧光定量PCR实验中，Ct数值非常重要，因为通过对标准物质进行定量PCR实验绘制出标准曲线，进而利用标准曲线法求出未知样本中的起始拷贝数。目前定量PCR仪器采用的是最大二阶导数法和样点拟合法计算Ct数值，其原因为实际工作曲线并没有相应的函数所能准确对应，因而采取以上两种方法。这里我举例说明一下使用样点拟合法计算Ct数值并进一步求算出起始拷贝数的过程。y = 4.416x - 80.128 当y=1.64 时 x=18.52y = 2.368x - ...

厦门大学第三届“荧光PCR－基础与应用”研习班通知（2008年11月30日—12月6日，厦门）实时荧光PCR以特异性强、灵敏度高、定量准确、全封闭等优点，已成为基础生物学研究的重要平台技术，正成为临床诊断新一代标准技术，广泛应用于传染病、遗传病、肿瘤等领域。为使广大一线工作人员全面掌握该技术，同时熟悉该领域的最新进展，厦门大学分子诊断实验室在2004、2006年成功举办两届研习班并获得广泛好评的基础上，再次携手国外实 ...