DNA原位杂交技术

RNA标记是将标记物（如放射性同位素、荧光素或酶）共价地连接到RNA，通过检测标记物，进而实现对RNA鉴别和检测的目的。RNA标记在分子探针领域应用广泛，在疾病诊断方面也很有前景。 理想的RNA标记方法应符合以下要求： 1. 操作简单，灵敏度高 2. 不影响碱基配对的特异性 3. 不影响RNA活性 4. 对酶促反应活性无影响或影响不大 ...

1. RNA探针： RNA探针的长度以50-150碱基为佳，探针易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。长500个碱基的探针杂交时间约需20个小时左右，如超过500个碱基的RNA探针则在杂交前用有限碱基水解法控制其长度。 （1）孵育时间t = Lf- Lo / K × Lo ×Lf （Lo=核酸探针原长度（kb），Lf=核酸探针水解后所需长度（kb），K是常数率= ...

某些标记探针必须经纯化后方可使用。这是因为在探针标记过程中，反应液中仍存在一些未被结合到探针中去的剩余dNTP等小分子。 为将掺入并结合到cDNA，cRNA和标记寡核苷酸与游离的标记寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化。 乙醇沉淀法的原理是：DNA可被乙醇沉淀，而未掺入DNA的dNTP则保留在上清液中，由此反复乙醇沉淀能将两者分开。 核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法的 ...

在RNA原位杂交中，不仅要选择适当的探针，而且还要使探针得到有效的标记。探针标记法有酶反应法和化学反应法。 1. 酶反应法：用于RNA探针的酶反应法主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5'端或3'端的一种标记法，末端标记适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。 2. 体外转录法：体 ...

在RNA的杂交检测实验中，应用标记的RNA 探针将获得高灵敏度的杂交检测结果，与DNA 探针相比，检测灵敏度提高10-100倍。因为对于不同的杂交体类型来说，RNA-RNA杂交体的结合强度高于RNA-DNA和DNA-DNA杂交体。对于通过Northern blots检测低浓度mRNA，以及原位杂交的核酸定位检测等应用，RNA探针是一种理想选择。RNA探针同样也适用于Southern blots， ...

引物延伸分析（primer extension analysis）主要用于mRNA 5′端作图。poly（A）+RNA首先与过量5′端标记的且与靶RNA互补的单链寡核苷酸引物杂交，然后用反转录酶延伸这个引物。产生的cDNA与RNA模板互补且长度与引物5′端和RNA 5′端之间的距离相等。该法在mRNA 5′端作图方面具有下述优势：一旦引 ...

一、引物延伸分析（primer extension analysis） 引物延伸分析用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端， 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域，随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸 ...

引物延伸实验一些常见问题： 1. 什么是引物延伸实验？ 引物延伸实验用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端， 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域， 随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到R ...

1. 加入适当体积的RNA（<12 μl）+探头（<3 μl）。 尝试5和10μg 的RNA加600或800页高辛标记的探针。 2. 包括2-3的酵母RNA样品/探针使用。 3. 加入20 μl SOLN。 A到所有涡管（FV =30 μl）和自旋向下。 4. 孵育90-95℃ ...

一、体外转录 在无菌1.5 ml 微型离心管中，结合以下内容： 4 ul 5倍转录缓冲液 2 ul 0.1 M DTT 4 ul 2.5 MM NTP（A，C，G） 0.8 ul RNA酶抑制剂（25 U/ul）RNA酶抑制剂（Promega）中 100 UM冷UTP 1 ul/ug UL线性DNA模板 5 ul10 UCI / UL P32 UTP（800Ci/mmol ...

一、材料准备 4μL5X T4激酶缓冲液 5 μl ATP（7000次/毫摩尔） 10 μl 水+寡核苷酸（200毫微克） 1μlT4激酶 1. 37摄氏度1小时 2. 热失活，在75℃下10分钟。 3. 加入1μl糖原（20毫克/毫升），2μl4M乙 ...

简介： RNA酶保护试验(RNase Protection Assay，RPA)是通过液相杂交的方式用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。 1. 原理：双链RNA（杂交的）能够抵抗RNA酶的降解。 2. 应用：检测RNA表达 3. 与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点： （1） ...

一、RNA酶A的小鼠细胞治疗介绍 RNA酶A透其次是免疫细胞治疗是一种方法，它允许显示的本地化涉及到细胞的蛋白质的RNA酶敏感的结构。这项技术是高度依赖所使用的RNA酶A的质量在我们的实验室中，我们用RNA酶A的小鼠细胞治疗表明，异染色质蛋白1（HP1）在臂间异染色质蛋白的富集取决于存在一种RNA成分。 二、材料与试剂 CSK缓冲液：（在-20°C贮存 ...

一、RNA酶保护试验（RPA） RNA酶保护试验（（RNase Protection Assay，RPA）即糖核酸酶保护实验（Ribonuclease protection assay，RPA）是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。本文主要介绍了核糖核酸酶保护分析实验的从试剂准备到、操作步骤以及实验结果全部的操作流程，供大家分享。 二、材料准备及操作步骤 ...

RNA的免疫共沉淀分离及检测 非编码RNA的发现使得RNA领域再次成为了生命科学研究关注的焦点。因为RNA是一种不稳定的生物大分子，绝大多数的RNA都需要与特定的RNA结合蛋白质结合形成RNA/蛋白复合物才能稳定存在于细胞中；不仅如此，RNA与RNA结合蛋白之间的动态关联贯穿和伴随了RNA的转录合成、加工和修饰、胞内运输和定位、功能发挥及降解的整个生命循环。鉴于此，利用RNA结合蛋 ...

一、文献 1. Chen H.H. J. Lebon and A.D. Riggs Analysis of RNA structure and RNA-protein interactions in mammalian cells by use of terminal transferase-dependent PCR. Methods Mol Biol 2008. 488: p. 319-41 ...

1. miRNA是什么？具有什么作用？ 答：microRNAs（miRNA）是一种内源性非编码小分子RNA，一般具有18到25个核苷酸，其序列在进化上高度保守，通过靶向特定mRNA来调节基因的表达。 miRNA是越来越受关注的转录后调控网络（post-transcriptional control）中重要的调控因子。首先，miRNA结合到核糖核蛋白（Ribonucleoprotein ...

一、RIP技术简介 由于miRNA被发现在癌症机理中起重要的作用，尤其是与肿瘤转移相关联，因此对于miRNA的研究来说，最让人兴奋的是有希望应有于癌症治疗中的RNA 抑制疗法或模拟miRNA表达疗法，尤其是对于出现肿瘤转移的癌症病人的治疗。 但是miRNA具有成百上千个靶标，所以要完全理解一个miRNA和靶标的特异性反应与肿瘤发生之间的联系，是一项非常具有挑战性的工作，尤其是在癌症研究中鉴别 ...

一、RNA蛋白免疫沉淀技术简介 RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。RIP这种新兴的技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的 ...

microRNA是一类约22nt的小分子RNA，调控基因表达。目前有研究显示，microRNA能以沉默复合体的形式稳定存在于人类的血清血浆中。癌症患者由于细胞破损，会释放一部分癌症特异的microRNA进入循环系统中，这部分microRNA就能作为生物标志物进行肿瘤的早期诊断。 安捷伦是国际领先的生物芯片制造企业。它生产的microRNA芯片通过独特的探针设计能区分成熟miRNA和 ...