基因克隆

re-loxP是一种位点特异的基因重组技术，被广泛应用于特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位，在真核生物和原核生物中均有广泛应用。Cre-loxP的基本原理Cre蛋白是一种重组酶，是causes recombination的缩写，于1981年从P1噬菌体中被发现，属于λInt酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号为X03453），编码38kDa蛋白质，Cre重组酶 ...

用的是clontech的kit.3.2.2.1cDNA第一链的合成1)在0.5ml经DEPC处理过的离心管中分别加入tester和driver的mtRNA各2ug，然后加入1ul(10uM) 随机引物(9mer)，70℃温浴2min,然后迅速置于冰上放置2min，然后在每管中加入如下混合物：5×First-strand Buffer 2uldNTPs Mix(10mM) 1ulsterile H2O 1ulAMV Reverse Transcripta ...

目的基因的亚克隆所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。一、试剂准备1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高 ...

PROTOCOLS FOR RECOMBINANT DNA ISOLATION, CLONING, and SEQUENCINGedited byBruce A. RoeJudy S. Crabtreeand Akbar S. KhanDepartment of Chemistry and BiochemistryThe University of OklahomaNorman, Oklahoma 73019e-mail: broe@ou.eduphone: 405 325-4912fax: 405 325-7762Augu ...

进了新实验室后一直用Gateway做克隆，发现论坛上很少有讨论gateway的帖子，特开此贴，也欢迎对gateway有经验，有兴趣和有疑问的同行们一起交流经验Gateway官方简介：Gateway®克隆技术的基础是lambda噬菌体的位点特异性重组反应，一种准确保存遗传信息的有效的自然的生化途径。与传统的需要DNA限制性内切酶、DNA连接酶、凝胶电泳和Dundefined*段纯化等多个步骤的单调乏味的亚克隆方法相比 ...

克隆心经——一套帮助新手快速作出克隆的Protocol本方法的核心部分是医科院基础所的生化脂蛋白组的吴刚老师所创，我在其基础上进行了一些改动，主要是DNA回收上采取了更简单的方法。（本方法最适用于双酶切制作片断并进行克隆的情况。对于分步酶切制作片断，也可以使用本方法，但需要加倍起始酶切DNA的量。）一、片断平移的克隆（也适用于多片断连接）简介：将用作载体的质粒A（制作大片断）酶切3μL ，要切出小片断的质粒B酶切7μL ...

本月旧帖整理活动专题: T-A克隆技术大家可以在以下基础上进行整理或对具体问题进行讨论(1)如何筛选合适的宿主菌株◇ 所选的宿主菌株应对所用质粒的抗生素抗性基因敏感。◇ 如进行蓝/白斑筛选，宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽编码区应在染色体或附加体上缺失掉（lacZΔΜ15）。TOP10和DH5α都能用于蓝/白斑筛选。◇ 要表达重组蛋白，可使用带有可诱导的T7 RNA聚合酶基因的菌株，如BL21（DE3）。◇ 使用pGEM载体克隆大片段时（7-8 kb）， ...

第一章　质粒DNA的碱裂解法提取与纯化——【核酸基因技术版】已有zein 和newdragon 编写初稿，请两位战友商量并及时更新，采用一个版本！第二章　基因组DNA的碱裂解法提取与纯化——【核酸基因技术版】已有zein 编写初稿，请及时更新！第三章　真核细胞DNA的制备与定量——【核酸基因技术版】已有yujz149 编写初稿，请及时更新！第四章 噬菌体DNA提取——【核酸基因技术版】第五章　核酸电泳——【核酸基因技术版】已有wangjun报名 编写初稿！第六章　感受 ...

gateway技术近两年开辟了高效克窿 转载新方法，特转载一篇于大家共赏，也欢迎更详细资料.GATEWAYTM克隆中基因看上去是什么样的？基因两端应该有att位点，在Entry克隆中是att L序列（100bp），而在表达克隆中是att B序列（25bp）。在att位点间的所有序列会和你的基因一起移动。因此，你必须预先决定是否包含诸如真核或原核翻译信号，或3'终止编码等DNA元件。我能克隆多大的片段？对于PCR产物，我们已经克 ...

--------------------------------------------------------------------------------丁香园生物技术参考书供所有DXY战友使用分 子 克 隆 参 考主编 （暂缺）副主编 （暂缺）编辑 liven dqlover biowind wangjun2002274 biotin编者 （报名参加的战友，排名不分先后）zein第一章　质粒DNA的碱裂解法提取与纯化第二章　基因组DNA的碱裂解法提取与纯化第六章　感受态细胞的制备newdragon第一章　质粒DNA的碱裂解法提取与纯化y ...

使用Clontech公司的In-Fusion PCR Cloning Kit快两年了，在此谈谈心得。早期的In-Fusion PCR Cloning Kit是干粉，现在已经发展成为试剂盒，两种我都用过。相关原理和具体操作步骤可以下载公司网站的说明书http://www.clontech.com/images/pt/PT4065-1.pdf。此方法最大的优点就是不用考虑插入片段的正反性，只要链接成功就是阳性克隆。但是有时候链接效率低，比较不容 ...

http://mededucation.bjmu.edu.cn/mc3/molecular%20clonging%203.pdfTable of Contents：Chapter 1: Plasmids and Their Usefulness in Molecular CloningChapter 2: Bacteriophage and Its VectorsChapter 3: Working with Bacteriophage M13 VectorsChapter 4: Working with Hi ...

做了快7年的分子克隆，从加样加不好，到现在轻松PCR，我想分子生物学这块还是有很多经验可以分享一下的。或许很多人会说分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在个步骤上很久。经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会，我认为连接的问题多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。有很多环节影响连接的 ...

一.Recommendations on how to handlethe clones you receiveThe clones you receive from us are shipped as bacterial LB agar stab culture.The DH10 E.coli host that is harboring the plasmid contains a DNA insert that has been placed into LB agar (containing 20 ug/ml chloramphenicol for BAC clones and 25 u ...

“分子克隆”第三版有下面两段话： DNA 和 RNA 纯制品的 OD260:OD280 值分别是 1.8 和 2.0，若样品中蛋白或酚的污染较严重，则 OD260:OD280 低于上述两个数值 (p1695 倒数第 5 行)。水饱和酚在 270nm 处有特征性吸收，其 OD260:OD280 比值为 2 (p1697 的框内倒数第 2 行)。当时看到时就觉得这两段话是矛盾的；翻看英文版，发现没有翻译上的错误。难道真的会出现这样的现象：在 OD260:OD280 比值为 1.8 的纯 DNA 中加入比值为 2 的水饱和酚，则比值会小于 1.8？试图找 ...

近年来，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因组编辑技术可谓是层出不穷，尤其是CRISPR/Cas9，一出现便在全球范围内掀起一股热潮。同时，各大公司也开发出一系列相应的产品，其中一种至关重要的就是基因敲除阳性克隆筛选的试剂。目前，市面上只有Genloci的CruiserTM、Transgenomic的SURVEYOR和NEB的T7EI这三种产品和测序这种方法，被用于基因敲除阳性克隆的筛选。然而，SUR ...

基因克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的Dundefined*段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此基因克隆又称DNA克隆、分子克隆、基因重组或重组DNA技术。基因克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的Dundefined*段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等。为了方便大家学习和交流，我以问答形式介绍基因克隆及其常见 ...

:(各位大侠：小弟最近做克隆实验遇到很大的障碍，已经连续三次失败了。请各位大哥帮助分析原因，小弟不胜感激！我克隆的是一个肿瘤标志物的基因片段，长约150bp 。具体过程如下：一，普通PCR，电泳，切下特异条带；二，用QiaGene公司胶回收试剂盒提取特异条带DNA，所得胶回收产物约30ul。取2ul做荧光定量PCR(该方法条件优化已完成)，证实胶回收产物中目的片段含量很高。三，用上海生工的PUCm-T载体试剂盒完成连接反应 ...

Gateway也可以被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的 ...

阳性克隆筛选方法汇总——基于ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9基因敲除方法 近几年来，基因重组的技术层出不穷，包括TALEN和CRISPR/Cas9在内的重组技术给基础研究提供更为方便和快捷的分子生物学工具。 关于这些技术的具体原理和操作细节，这里不做展开介绍，主要谈一谈在用这些技术进行细胞株构建的过程中，如何做才能加快阳性克隆筛选的步伐,做好这个关键的步骤。一. 混合克隆pool验证 质粒转染后48-72小时后取转染后 ...