Southern Blotting

本人做的植物转基因技术方向，由于要做一些杂交技术来验证外源基因的整合与表达情况，故将自己在做实验中遇到的一些问题以及注意事项想告诉大家，同时希望和朋友们一起交流探讨。Southern Blot:1.首先是提取大量DNA，由于不同的材料的基因组大小不一样，故上样量也不同，但上样量还是要大一些为好，一般30-50微克左右，若你的DNA质量非常好，一般20微克左右就可以，有的材料如獐茅10微克就可以。注意，上样量与DNA质 ...

Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱 ...

Southern Blot ProtocolsSouthern Blot Protocol Southern blot和Northern blot （交流）精彩southernblot FLASH Southern 杂交操作规范及污染防护 要Southern PPT吗？Southern Blot 问题 Southern 杂交的高手之见 Southern转膜的方法求助 用southern blot鉴定转染基因时遇到的一些问题 转基因检测老是失败，可能原因有那些呢？ 请教southern blot ...

用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA转移至一固相支持滤膜。利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。 （一） 器材： ...

Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的 ...

X-tremeGENE DNA Transfection Reagent是一种非脂质体、多组分转染试剂，已被证明可有效转染多种细胞。X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP在有无血清条件下均可进行转染，且细胞毒性低，转染后无需更换培养基。 降低转染试剂本身的脱靶效应是非常重要的： n在长时间内保证转染目标基因的高表达率 n减少死细胞数目及其释放的蛋白 ...

1）取10ul待测DNA，于一定浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳。(20mL1.0%凝胶)2) 凝胶用溴化乙锭染色，切掉凝胶四周多余部分，并在凝胶的一角作一记号 拍照记录电泳结果(拍照时 凝胶旁放一尺子)。3) 杂交用胶的制备 (做以下步骤两组合一)A．将凝胶浸没入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min，使DNA脱嘌呤。B．用蒸馏水短暂洗凝胶2次。C．将凝胶浸没入30mL变性液中30m ...

一 基因组酶切和电泳在200 μl 微量离心管中加入：25 μl DNA样品(约10μg)，3μl 限制性内切酶（MBI，10 U/ μl）5 μl 相应的10×buffer，补水到50μl。然后加一滴矿物油覆盖 稍微离心后放于37℃水浴8-12小时。酶切完后，取5μl 酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上检测酶是否充分。如果酶切充分，灌制0.8%的agrose胶，加入上样buffer后，在25 ...

1）基因组DNA Southern印迹的制备 预备 1．用适当的限制性内切酶消化基因组DNA样品（10μg）。 2．进行琼脂糖凝胶电泳。一般用0.7～1.0％的琼脂糖凝胶分离基因组DNA，它在1～15kb的范围内有较好的分辨率，可选用TBE或TAE缓冲液。琼脂糖凝胶电泳需在1V/cm的电压下进行，如果要分离片段大小相似的DNA带，应用较大的凝胶（20×25cm）。常用的标准品是由Hind Ⅲ消化的 ...

物理显影液的配制：硝酸银显影液、乳酸银显影液、醋酸银显影液、彩色显影剂的配制、漂白液的配制、定影液的配制、缓冲液。

在胶体中的DNA 可利用毛细现象的作用将DNA 牵引转印至覆盖在胶片上的滤膜，经烘烤或UV 照射后，可使DNA 固定在膜上，以进行探针的杂合（hybridization） 反应。

进行杂合反应时所使用的探针若为放射性物质所标定者，杂合讯息可经由放射显影术 （autoradiography） 侦测出来；若为DIG所标定者，则需借助anti-DIG抗体与碱性去磷酸酶 （alkaline phosphatase, AP） 的conjugate,并利用碱性去磷酸酶的酵素活性转现杂合反应讯息。 目前常用来进行碱性去磷酸酶呈色反应的基质为NBT （nitroblue tetrazolium） 与BCIP （5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,toluidinium salt）； 此外，也可以选用CSPD或CDP-Star等试剂，以增加检测敏感度。

1、取适量小麦基因组DNA，用适量的限制性内切酶消化完全（约5 U/mg DNA，酶切12 h左右），取少量电泳检测酶切完全性；然后依次用酚：氯仿和氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀。而后溶解在20 ml TE Buffer中；2、在1%的琼脂糖凝胶上电泳10~12 h，电压为3 V/cm；……

一、原位杂交( In Situ HybridizationISH) 是用标记的核酸探针，使用非放射检测系统或放射自显影系统，在组织切片、细胞涂片及染色体制片上等对核酸进行定性、定位和相对定量研究的一种分子生物学方法，具有灵敏、特异、直观等优点。已逐渐成为分子生物学和分子病理学的常见技术之一，广泛应用于肿瘤生物学、血液病理学、遗传、微生物学、细胞和分子生物学、神经内分泌学、免疫学等领域及治疗评估和 ...

A. Process gel 1. Electrophorese sample in agarose gel 0.5 to 1 cm thick 0.5-1.2%. 2. Expose gel to UV light for 1 min on 265 nM light box (or depurinate in 2 vol of 0.25M HCl for 2X15' and rinse in d ...

Southern Analysis Procedure (for analysis of genomic DNA or ordering of clones): 1) Prepare genomic DNA (ref.p.9.22 Maniatis) from cultured cells using one T75 flask (wash two times with PBS and the ...

BUFFERS: 1 ...

DNA PrepPrepare DNA via your favorite method. You may find a protocol underMini Yeast Genomic Prep.Restriction Digest1.Digest DNA with appropriate restriction enzyme. Digest 10μg of Yeastchromosoma ...

Steve Hahn Last Modified FriApr 252003 Wear gloves throughoutuse RNAse free solutions (either autoclaved or sterile filtered)and clean bench and pipetmen with 95% ethanol before use to eliminate any s ...

【原理】 Southern 印迹是将电泳分离的 DNA 片段转移到一定的固相支持物上的过程。 DNA 分子经限制性核酸内切酶酶切，经琼脂糖凝胶电泳将得 DNA 片段按分子量大小分离，然后将含 DNA 片段的琼脂糖凝胶变性，并将单链 DNA 片段转移到硝酸纤维素膜或其它固相支持物上，而各 DNA 片段的相对位置保持不变，这种滤膜可用于杂交反应。利用 Southern 印迹法可进行克隆基因的酶切图 ...