DNA基础知识

该法 可 ...

TRANSFORMATION (ONE-STEP PEG METHOD) 1.Dilute 1:100 a fresh O/N culture of bacteria into prewarmed LB broth and incubate cells with shaking (225 rpm)to an OD600 of 0.3-0.4. 2.Add an equal volume of ic ...

I have read some books but cannot find the answer.I think NaAc may increase the ionic strength to stabilize DNA duplexes.Is it right? Thanks. -freshman- ----------------------------------------------- ...

该法是R.Treisman尚未发表的方法同时也是Brinboim和Doly(1979)及Ish-Horowicz和Burke(1981)所用方法的改进。该方法对于目前使用的所有大肠菌菌株都卓有成效并可与随后的纯化步骤如聚乙二醇沉淀或氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心等一并联合使用。注:括号中给出的体积可适用于未经氯霉素处理的培养。 试验准备: 1、溶液I:50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tr ...

克隆成功与否除与连接方式以及载体选择有关外载体的处理也是一个重要环节。为了提高连接效率处理载体时应注意以下几点: (1)应加入常用量5~10倍的内切酶水解载体以保证载体被完全酶切; (2)如用双酶切割载体则必须电泳回收载体片段除去双酶切所产生的小DNA片段;�(3)如粘端连接单酶切处理过的载体必须用 碱性磷酸酶 (如牛小肠碱性磷酸酶CIP)处理防止载体自身环化。 CIP 可以水解掉DNA5末端的 ...

1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好，平端连接需要过夜反应。 2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。 足够多的载体和插入片段是最重要的 。要看片段具体情况而言，有时载体和片段浓度过高，容易产生线性化产物，不利于环化的。插入的DNA的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍，这个很关键。载体通常50ng就够了，若载体在10k ...

利用D NA 连接酶把载体 DNA 和要克隆的目的 DNA 片段连接在一起，成为一个完整的重组分子，这就是分子克隆中常说的连接反应。当载体 DNA 和外源 DNA 末端都是由一种产生粘性末端的内切酶切割产生的话（同尾酶也可以），或者两者末端被接上一段互补的多聚体的尾巴，那么经退火后可形成新的重组分子。连接后产生的重组分子中仍然保留着外源 DNA 两端的限制性内切酶切点 ，从而使我们能方便地从重组 ...

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA 片段，从而免除基因重组和分子等一系列繁琐操作。由于这种方法操作简单、实用性强、灵敏度高并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。 PCR进行的基本条件是： （1）以 ...

Cepko/Tabin Lab Harvard University http://axon.med.harvard.edu/~cepko/protocol/mike/R1.html Protocol R.1 Random Prime Labeling of DNA Solutions Buffer A 1.25 M Tris 8.0 625 ml 2M Tris 8.0 2 125 ml 1M ...

hi thereI have been trying to clone 3.4 kb insert into pcDNA3.1- for months without any success.The insert is subcloned in TOPO from where I cut it out by KpnI and NotI and purify it by gelelectrophor ...

1.O/N (5ml E.coli in LB-->1ml into 200ml LB/37℃ 2.Grow 2-3H to A660 ~0.3-0.4 3.Chill cells 10'/ice Spin down 10'5K4℃ 4.Wash 1X 200ml 10% glycerol (sterile)40℃; Spin down 10'5K4℃ 5.Wash 1X 40 ml 10% ...

鉴定转基因植物的第一步就是要确定被转基因已经稳定的整合到了染色体上。第二步任务就是评估有多少个转基因拷贝，以及每个转基因的表达水平如何。一般经过上游表达载体的设计构建以及下游转化体系的建立、转化品系的筛选鉴定等一系列步骤后，即获得 T 0 代转基因植物。在转化过程中，外源 DNA 随机插入植物内，插入的拷贝数和位点都不固定。插入外源基因的拷贝数低（1或2个）能较好的表达，插入的拷贝数多则会导致表达 ...

带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞 瞬时转染 相对简便、重复比磷酸钙好但对细胞有一定的毒副作用转染时需除血清且一般只用于BSC-1CV-1COS细胞系 Sigma-Aldrich(DEAE-Dextran Transfection Kit)磷酸钙法 磷酸钙DNA 复合物吸附细胞膜被细胞内吞 稳定转染染瞬转染 不适用于原代细胞（所需的DNA 浓度较高）操作简 ...

重组DNA技术涉及到组合不同来源的遗传信息，从而创造自然界以前可能从未存在过的遗传修饰生物体（genetically modified organisms，GMOs）。最初，在分子生物学家中有人担心这些生物体可能具有不可预测的不良性状，一旦从实验室逸出将带来生物学危害。这种担心在1975年美国加利福尼亚州阿西洛马市召开的科学会议上成为焦点。在那次会议上讨论了重组DNA技术的安全问题并提出了第一个重 ...

BAC提取前准备（前两天 ） 配制含25 mg/l Kan的LB培养基选择平板，在超净工作台上用接种环从购买的BAC划线接种至选择平板，于37℃培养箱培养过夜，供选择单。 BAC提取前准备（前一天） 1、在超净工作台上，用50 µg/ml Kan和液体LB培养基配制成25 mg/l Kan培养基，每个Falcon试管分装10 ml。也可先分装10 ml无抗生素的液体LB培养基后，然后每 ...

Sanger双脱氧链终止法 Maxam－Gilbert DNA化学降解法 测序策略 目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变 ...

Note All centrifugation speeds are given in units of g.Please refer to Table 1 for information on vonverting g -force to rpm.If centrifuges/rotors for the required g -forces are not availableuse the m ...

一．农杆菌感受态细胞的制备 （同大肠杆菌质粒DNA的提取），然后将其转化大肠杆菌，再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。 取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养2天。挑单菌落接种于5ml YM（0.5g/L KH2 PO4 10 g/L Mannitol2 g/L L-Glutamine0.2 g/L NaCL0.2 g/L MgSO4 0.3 g/L ...

现代分子生物学研究发现，中药材(不含矿物药)所依赖的生物资源――“物种”的多样性是由于其基因多态性的结果，而基因多态性可在分子水平上检测，它比在形态、组织和化学水平上检测更能代表其变异类型的遗传标记。传统的分子标记主要有血清学特征、蛋白质谱 、同工酶谱，近10年来则有迅速发展起来的DNA 分子标记，现介绍如下。 1 　传统的分子标记 1.1　抗血清　中药有许多具有抗原决定 ...

Pyrosequencing是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的、精确和重复性好的分析的技术。 第一步——测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交，与酶—DNA聚合酶（DNA polymerase）、ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）、荧光素酶（luciferase）、三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）—和底物&mdash ...