免疫检测分析

免疫金银染色方法敏感、简便、省时、安全可靠，葡萄球菌A蛋白（SPA）金标记四步法是在此基础上发展起来的更为敏感的一种新方法。SPA和许多哺乳类动物IgG具有亲和性，且它们之间的连接不会干扰抗原-抗体的结合。

彩色免疫金银染色方法的基本原理是在IGSS法的基础上，根据洗彩色照片的显影原理而发展起来的，即IGSS后，在抗原位点处生成的银颗粒经铁氰化钾与溴化钾的氧化反应，将银颗粒氧化成溴化银，后者与彩色显影剂起还原反应，生成金属银，而彩色显影剂本身则被氧化，其氧化产物使彩色成色剂由五色变成有色的染料，并沉积在银颗粒的部位，金属银变成了银离子。由于染料只能通过彩色显影剂沉积在有银的部位，不会发生非特异性背景染色。

转印到纸上的蛋白质抗原，可与其专一性抗体结合，再以二次抗体-酶结合体（2nd Ab-HRP） 或Protein A-HRP 呈色；可在一群转印色带中，专一性地挑出目标蛋白质，是最有用的检定工具 （Burnett,1981）。

夹心ELISA溶液准备： 包被液：50mM Na2CO3（ pH9.6 ）， 20mMTris-HCl( pH8.5 ） 或10mM PBS （ pH7.2 ）封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等洗涤液：0.02-0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris盐缓冲液 （ pH7.4 ）AKP偶联的链球菌亲和素溶液：用1×封闭液稀释酶偶联物

间接ELISA溶液准备：包被液：50mM Na2CO3 （ pH9.6 ），20mMTris-HCl （ pH8.5 ） 或10mM PBS （ pH7.2 ）封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等洗涤液：0.02-0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris盐缓冲液（ pH7.4 ）

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。

在目前的以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。一般商品试剂盒显色反应条件为37℃或室温反应15~30min。从理论上说，37℃30min才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10min内，绝大部分催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37℃下反应25~30min后，终止反应比色测定。

已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。

ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。

ELISA测定操作规程（以小鼠TNF-a为例）

该protocol应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中脂联素水平。通过显色反应，用酶标仪测定吸光度，计算样品浓度。

优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式ELISA。

垂体前叶分泌的促甲状腺激素(Thyroid Stimulating Hormone TSH)的相对分子质量约为25000–28000，与腺垂体分泌的卵泡刺激激素(Follicle Stimulating Hormone FSH)、黄体生成素(Luteinizing Hormone LH)以及胎盘分泌的人绒毛膜促性腺激素(human Chorionic Gonadotropin hCG) ...

时间分辨荧光免疫分析（Timeresolved FluoroimmunoassayTRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。 解离增强镧系元素荧光免疫分析 解离增强镧系元素荧光免疫分析（Dissociation Enhance ...

【摘要】本文研究时间因素对应用CharmⅡ放射免疫分析方法测趸磺赣类药物残留试验的影响，试验结果说明如果延长或缩短操作时间，将影响检测结果，因此在操作中要快速，保证检测的准确性。 【关键词】放射免疫分析 磺胺类测定 时间 【中图分类号】R155．51&nb ...

1、放射性核素衰变表 3 H 35 S 32 P 125 I ...

（一）原理 IRMA是采用过量的标记抗体与待测抗原的非竞争性结合反应，然后加入固相的抗原吸附剂以结合游离的标记抗体，离心去沉淀，测定上清液中的放射性强度，从而推算出待测样品的抗原含量。 （二）放射免疫检测与免疫放射检测(即IRMA与RIA)的区别 见表13－4。 表13－4 IRMA与RIA的区别 ...

透射比浊与散射比浊是免疫比浊的常见的两种方法，其反应的原理一样，只是检测的光信号与仪器的检测器有区别。 两者各有优缺点，简述如下： 1、透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的周期较长。 2、散射比浊的优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。 两者均采用的 ...

标准品是标记免疫分析定量的依据。标准品的正确与否直接影响样品的测定结果。如果在连续测定中，或各实验室之间使用的标准品不一致，则可影响到实验结果的可比性。为此，对标记免疫分析所使用的标准品应满足如下要求。 1、化学结构：原则上标准品应与被测物具有完全相同的化学结构，包括相同的立体化学结构。但在实际工作中，用化学结构完全相同的物质作标准品是十分困难的。这是由于一方面来源有限，另一方面有些被测物本身的化 ...