抗体抗原实验

免疫沉淀蛋白的样本制备（蛋白质的电泳分离）一般情况下，粗提样品无需进一步纯化即可直接进行凝胶电泳。但下述两种情况在免疫印迹之前，使用免疫沉淀制备蛋白的效果较好。一是含量极稀少蛋白的检测，由于适合凝胶电泳分辨的蛋白质总量有一定限度，通常不可能在凝胶中加入足够量的蛋白质样品来检测含量极稀少的抗原，此时可采用标准的免疫沉淀技术纯化和浓缩待测蛋白；二是免疫沉淀可用来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用，此时 ...

从免疫亲和层析柱上洗脱抗原方法【准备工作】此步骤最大的难点是确定恰当的洗脱条件。为了获得一个清晰的洗脱峰和较纯的抗原，需要花费大量的时间进行试验和调整洗脱条件。【溶液和特别设备】（1）预洗脱缓冲液（2）洗脱缓冲液（3）中和缓冲液（4）简单的层析装置（5）透析袋及相应的装置 如果是对蛋白层析很有经验者可采用分段增加洗脱条件而不采用逐步洗脱。【操作步骤】(1)用20倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱 ...

洗脱抗原常用试剂试剂 洗脱缓冲液 预洗脱缓冲液 中和缓冲液 层析柱再使用 高pH100mM 三乙胺pH 11.5100mM 酸式磷酸盐pH 12.510mM 磷酸盐pH 8.010mM 磷酸盐pH 8.01 M 磷酸盐pH 6.81 M 磷酸盐pH 6.8经常偶而低pH100mM 甘氨酸pH 2.5 100mM 甘氨酸pH 1.810mM磷酸盐pH 6.810mM磷酸盐pH 6.81 M ...

快速裂解酵母细胞制备样本（蛋白质的电泳分离） 使用这种方法会使蛋白质变性，在所用抗体能识别变性靶蛋白时才能使用这一方法。【试剂与设备】（1）待检测的酵母菌（2）25%三氯乙酸（TCA）（3）1%SDS（4）丙酮（5）RIPA缓冲液： 50mmol/L Tris•HCl (PH7.5) 150mmol/L NaCl 1% Nonid ...

哺乳动物细胞和组织的样本制备（蛋白质的电泳分离） 哺乳动物细胞和组织有单层培养细胞、悬浮培养细胞和组织碎片，虽然均可采用凝胶加样缓冲液裂解的方法来制备样本，但制备方法有所差异。1、对单层细胞的处理方法【试剂与设备】（1）磷酸缓冲盐溶液（PBS）（2）1×SDS凝胶加样缓冲液（参见上述“细菌表达蛋白质和样本制备”）（3）水浴箱（4）吸管、细胞刮棒等【操作步骤】（1） 用磷酸缓 ...

转印后切取印迹膜 有时转印后需将印迹剪成较小的片状进行单独处理。单个泳道可以泳动同一样品，待彼此分开后，可用不同的抗体并列检测。如以电泳方向剪膜，就可在同一样品中检测不同分子大小的抗原。为了简便而精确地找到泳道，电泳之后用丽春红S（Ponceaus S）或印度墨汁对印迹膜进行染色，便可很快确定待测蛋白质的位置并将其剪下。表表明两种染料的的适用范围及优缺点，用丽春红S染色的优点是操作简便，价 ...

免疫荧光标记技术 免疫标记技术（immunolabelling techniques）是使用荧光素、酶、放射性核素、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂等作为示踪物，对抗原或抗体标记后进行的抗原抗体反应；并借助于荧光显微镜、酶标检测仪、射线测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性或定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析 ...

影响免疫印迹的抗体的性质与待检测蛋白质的含量 影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位的性质。只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合。多数多克隆抗血清中或多或少地含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。相反，许多单克隆抗体不能与变性抗原反应，因为它识别的表位依赖于抗原蛋白正确折叠所形成的三维空间构象。表显示各种抗体的优缺点。抗体的选择 多克隆 ...

荧光抗体的质量鉴定与保存 荧光抗体的质量通常用抗体效价和结合比率（F/P比值）来表示。1、抗体效价：一般用琼脂双向扩散法测定。中央孔内加抗原（1 mg/ml），抗体稀释度在1:16-1:32呈阳性者较为理想。2、荧光素（F）与蛋白质（P）结合比率（F/P比值）法 F/P比值系指荧光素与抗体蛋白的克分子比值，是标记抗体质量鉴定的重要指标之一。该比值以1-2（抗球蛋白荧光抗体）或略高于2（ ...

经典的荧光抗体技术基本原理(1)直接法直接法是荧光抗体技术最简单、最基本的方法。它通过标记抗体直接与相应抗原（待检抗原标本）结合，来鉴定未知抗原。其优点为：①由于在反应中只有两种因子参与，结果判断较简单；②特异性强，与其他抗原交叉染色较少；③操作步骤少，方法简便、省时。其缺点有；①敏感性较差；②一种标记抗体只能鉴定一种抗原；③不能用于鉴定未知抗体。(2)间接法间接法是目前最常用的方法。首先用已 ...

荧光偏振免疫分析（以环孢霉素检测为例）【基本原理】 荧光偏振免疫分析（FPIA）是一种利用物质分子在溶液中旋转速度与分子量大小呈反比的特点，定量检测抗原或抗体的一种分析方法。Ag或荧光标记的Ag（AgF）旋转比Ag-Ab或AgF-Ab复合物快，当接受一个偏振光面的投入时，如AgF分子的长轴与投入的偏振光面平行，荧光物吸收的偏振光最多，分子呈激发态，当回到基态时发射一个偏振光。如果反应液中的 ...

时间分辨荧光免疫分析（以血清中T3和T4检测为例） 时间分辨荧光免疫分析（time resolved luoro-immunoassay，TrFIA）技术出现于20世纪80年代初期，是在免疫荧光分析的基础上发展的一种新型超微量物质免疫分析方法。TrFIA采用镧系稀土元素标记抗体，利用荧光发射体的荧光寿命差别将波长相同的荧光分开，排除样品中的非特异荧光的干扰，从而最大限度地提高分析方法的灵敏 ...

酶标抗体的制备试剂及配制（1）辣根过氧化物酶（HRP）（2）抗体：要求见上节“荧光抗体的制备”（3）交联剂：戊二醛，过碘酸钠（4）0.05mol/L， PH9.5碳酸盐缓冲液(CBS) NaHCO3 2.94g Na2CO3 1.59g 蒸馏水加至 1000ml（5）1.0mol/L， pH9.5 ...

戊二醛二步交联法制备酶标抗体 戊二醛（glutaraldehyde，GA）：是一种常用的同型双功能交联剂，它的两个醛基可分别与HRP和抗体蛋白的氨基形成Schiff碱（-N=C-），将他们以五碳桥连接起来。戊二醛连接反应是最温和的交联反应之一。可在4-40℃范围，pH6.0-8.0的缓冲液中进行。另外，GA缩合体使被结合的蛋白分子与分子之间的间隔延长，可免于使蛋白分子的三级结构发生改变。 ...

改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体 HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成Schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白中残留的a-和e-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠还原成稳定的结合物。(1) 取HRP 5mg溶于0.2mol/L，pH5.6醋酸盐缓冲液1ml中，加入1%DNFB无 ...

核苷和核苷酸的标记〔γ-32P〕-ATP标记 基因工程已广泛应用于医学诊断、重组新的分子、物种和品系。32P-核苷酸类在基因工程研究中不可缺少的核素标记的化合物。制备这类标记化合物的方法有化学合成法、化学酶促合成法和酶促合成法等。其中常用酶促合成法最常用，其优点是需要设备少，操作简便，时间短，易防护，标记物的放射性比活度高，能够满足基因工程中进行DNA标记及分子杂交等工作要求。【基本原 ...

酶标抗体和酶-抗酶复合物的应用于免疫酶组化技术（APAAP法）【基本原理】 碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶染色法(APAAP法)，是一种免疫组化技术。用兔抗鼠IgG起搭桥作用，其中一个Fab段连接McAb ，另一个Fab段连接APAAP复合物，再通过复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色来判断抗原分子的存在。该方法由于使用免疫桥联技术，故其敏感性高，结果易于判断，同时又减少了内源性酶的影 ...

蛋白质、多肽的放射性核素（125I）的标记氯胺T法（ch-T法）【基本原理】反应原理不清楚，仅仅是建立在实验基础上，有的学者认为当氯胺T溶于水后释放出次氯酸，将I~F离子氧化成I2、I~D，在pH为7.0-8.0条件下与蛋白质酪氨酸残基上邻位氢原子发生置换反应，形成放射性碘标记化合物，用偏重亚硫酸钠终止氧化反应，经过分离纯化，获得纯的标记化合物。【试剂及材料】（1）0.05mol/L和0.1m ...

胶体金的制备 胶体金是氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。根据实验需要，可以利用不同的还原剂制备成直径大小不同的胶体金颗粒。（一）白磷还原法【试剂及材料】（1）HAuCl4水溶液（2）0.2mol/L K2CO3（3）白磷乙醚饱和液：在水中将白磷切成小片，用镊子快速取出，在滤纸上吸干后，放入小瓶，迅速加入10ml纯乙醚，塞紧瓶口，轻轻摇动至少2h，使乙醚充 ...

彩色免疫金银染色法【基本原理】 彩色免疫金银染色法是抗原位点处生成的银颗粒经铁氰化钾与溴化钾的作用被氧化成溴化银，后者与彩色显影剂反应被还原成金属银，而彩色显影剂本身则被氧化，其氧化产物使彩色还原剂由无色变为有色的染料并沉积在银颗粒部位，金属银变成银离子。【试剂及材料】（1）Lugol’s碘液（2）含5%硫代硫酸钠和1%亚硫酸钠溶液（3）2%铁氰化钾和1%溴化钾溶液（4）其余试剂同上【 ...