免疫学技术

抗体-蛋白A或-蛋白G微珠层析柱的制备 蛋白A或蛋白G微珠-抗体层析柱是免疫亲和层析技术中最常用的微珠基质之一。此类层析柱容易制备，由于抗体分子是通过Fc段与微珠基质结合，抗原结合片段（Fab）可与抗原最大限度地发生作用。以下介绍的方法可用于蛋白质抗原的纯化，但类似的方案也适用于任何其他抗原。 抗体可直接与蛋白A或蛋白G结合。根据抗体与蛋白A或蛋白G的亲和力，可以选用蛋白A或蛋白G微 ...

常用交联剂交联剂化学名同源或异源双功能反应基团蛋白结合基团光激活性间隔臂长(A)DMA二甲基二亚胺酯同源亚胺酯-NH2N8.6DMP二甲基亚胺酯同源亚胺酯-NH2N9.2DMS二甲基苯二酸亚胺酯同源亚胺酯-NH2N11DSG琥珀酸辛二酸戊二酸盐同源N-羟基琥珀酰亚胺-NH2N7.7DSS琥珀酸辛二酸二亚胺同源N-羟基琥珀酰亚胺-NH2N11.4BMH马来酰亚胺己烷同源马来酰亚胺-SH2NMBS ...

抗原与抗体-微珠基质的结合 虽然使抗原有效地结合到免疫亲和柱上的方法很多，因为抗体是通过共价键交联在微珠上，而不是游离于溶液中，所以交联在微珠上的抗体与抗原结合所需的时间比抗体和抗原二者以游离状态在溶液中所需的时间要长得多，因此，选用的方法应使抗原与交联的抗体达到最大程度的结合。推荐使用两种结合方法：将抗原溶液加入呈糊状的抗体-微珠内，不断混和均匀；或将抗原溶液流经抗体-微珠层析柱，保持抗 ...

从免疫亲和层析柱上洗脱抗原类型 实际上，从免疫亲和层析柱上洗脱抗原的操作比较简单，而且也比较迅速。主要工作是设计和摸索各种有效的洗脱条件。可以采用三种类型的方法进行洗脱，使抗原抗体复合物解离：①使用较苛刻的条件；②加入模拟结合位点的饱和量小分子化合物，和／或③使用一种能引起构象改变而使抗原释放的试剂。 最常用的洗脱方法是基于破坏抗体与抗原之间的结合键。洗脱条件可以较为强烈，使抗体和 ...

在混悬液中结合：抗体-微珠匀浆法 这是一种使抗体-微珠基质快速捕获抗原的方法，将抗原溶液与微珠混合，搅拌或振荡制成匀浆。这种方法可使抗原与固相化的抗体最大限度地接触。结合反应完成后，将匀浆装入层析柱内，以便收集结合有抗原的抗体-微珠和洗脱抗原。此法可以很好地控制反应时间，充分的利用了抗体结合容量。这比上面介绍的直接用层析柱捕获抗原方法麻烦一些。主要是因为用匀浆装柱比较困难；另一个问题是在混 ...

抗原结合到抗体-微珠基质层析柱上 为了将抗原结合到抗体微珠基质上，最简单方法是将微珠装到一个层析柱内，再将抗原溶液流经层析柱，当抗原流经层析柱时结合到抗体上而被固定，直到洗脱时才洗脱下来。这种方法的效率取决于抗原与固定的抗体之间的接触时间，通过控制流速，可以改变抗原抗体之间的作用时间。【准备工作】 开始前，要考虑层析柱的类型和尺寸。一般来说，粗而矮的柱子比细而高的柱子容易获得陡峭的 ...

免疫沉淀蛋白的样本制备（蛋白质的电泳分离）一般情况下，粗提样品无需进一步纯化即可直接进行凝胶电泳。但下述两种情况在免疫印迹之前，使用免疫沉淀制备蛋白的效果较好。一是含量极稀少蛋白的检测，由于适合凝胶电泳分辨的蛋白质总量有一定限度，通常不可能在凝胶中加入足够量的蛋白质样品来检测含量极稀少的抗原，此时可采用标准的免疫沉淀技术纯化和浓缩待测蛋白；二是免疫沉淀可用来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用，此时 ...

从免疫亲和层析柱上洗脱抗原方法【准备工作】此步骤最大的难点是确定恰当的洗脱条件。为了获得一个清晰的洗脱峰和较纯的抗原，需要花费大量的时间进行试验和调整洗脱条件。【溶液和特别设备】（1）预洗脱缓冲液（2）洗脱缓冲液（3）中和缓冲液（4）简单的层析装置（5）透析袋及相应的装置 如果是对蛋白层析很有经验者可采用分段增加洗脱条件而不采用逐步洗脱。【操作步骤】(1)用20倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱 ...

洗脱抗原常用试剂试剂 洗脱缓冲液 预洗脱缓冲液 中和缓冲液 层析柱再使用 高pH100mM 三乙胺pH 11.5100mM 酸式磷酸盐pH 12.510mM 磷酸盐pH 8.010mM 磷酸盐pH 8.01 M 磷酸盐pH 6.81 M 磷酸盐pH 6.8经常偶而低pH100mM 甘氨酸pH 2.5 100mM 甘氨酸pH 1.810mM磷酸盐pH 6.810mM磷酸盐pH 6.81 M ...

快速裂解酵母细胞制备样本（蛋白质的电泳分离） 使用这种方法会使蛋白质变性，在所用抗体能识别变性靶蛋白时才能使用这一方法。【试剂与设备】（1）待检测的酵母菌（2）25%三氯乙酸（TCA）（3）1%SDS（4）丙酮（5）RIPA缓冲液： 50mmol/L Tris•HCl (PH7.5) 150mmol/L NaCl 1% Nonid ...

哺乳动物细胞和组织的样本制备（蛋白质的电泳分离） 哺乳动物细胞和组织有单层培养细胞、悬浮培养细胞和组织碎片，虽然均可采用凝胶加样缓冲液裂解的方法来制备样本，但制备方法有所差异。1、对单层细胞的处理方法【试剂与设备】（1）磷酸缓冲盐溶液（PBS）（2）1×SDS凝胶加样缓冲液（参见上述“细菌表达蛋白质和样本制备”）（3）水浴箱（4）吸管、细胞刮棒等【操作步骤】（1） 用磷酸缓 ...

转印后切取印迹膜 有时转印后需将印迹剪成较小的片状进行单独处理。单个泳道可以泳动同一样品，待彼此分开后，可用不同的抗体并列检测。如以电泳方向剪膜，就可在同一样品中检测不同分子大小的抗原。为了简便而精确地找到泳道，电泳之后用丽春红S（Ponceaus S）或印度墨汁对印迹膜进行染色，便可很快确定待测蛋白质的位置并将其剪下。表表明两种染料的的适用范围及优缺点，用丽春红S染色的优点是操作简便，价 ...

印迹膜蛋白染色【所需试剂】（1）2%丽春红S浓贮存液（3-羟基-4--2，7-萘二磺酸）：溶于30%三氯醋酸和30%磺基水杨酸中。贮存液可在室温下稳定存放1年以上。（2） PBS。【操作步骤】（1）在染色之前，先配制丽春红S的应用液。即将2%的丽春红S浓贮存液用1%醋酸1:10稀释即成为应用液（注意：如果使用硝酸纤维膜，须将丽春红S应用液更换为用水1:10稀释）；（2）用丽春红 ...

间接免疫印迹检测的方法【准备工作】 在准备做抗原检测时，须考虑所用一抗和二抗的最佳浓度，对不同来源的抗体，其特异性抗体的浓度都不相同。因此，对一抗体进行滴定有助于确定最佳反应比例，预先滴定二抗对实验也有帮助，一旦确定最佳浓度，则每次印迹即可用同一批一抗、二抗来完成。多数情况下可采用商家提供的浓度进行检测。【材料与试剂】（1） PBS：称取8g NaCl；0.2g KCl ...

免疫检测主要取决于抗原抗体的特异性，特别是能够识别膜上变性的和固定化抗原的抗体。因印迹膜上有非特异性吸附蛋白质的位点，因此需进行封闭以防免疫试剂的非特异性吸附。将印迹膜与一定浓度的不参与特异性反应蛋白质或去污剂溶液孵育可实现封闭。然后通过抗体与膜上抗原的特异性结合来定位抗原。抗原可用易观察的标记的抗体进行检测。抗体本身可以标记，直接用于检测抗原，但更为常见的是，使用的抗 ...

免疫荧光标记技术 免疫标记技术（immunolabelling techniques）是使用荧光素、酶、放射性核素、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂等作为示踪物，对抗原或抗体标记后进行的抗原抗体反应；并借助于荧光显微镜、酶标检测仪、射线测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性或定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析 ...

影响免疫印迹的抗体的性质与待检测蛋白质的含量 影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位的性质。只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合。多数多克隆抗血清中或多或少地含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。相反，许多单克隆抗体不能与变性抗原反应，因为它识别的表位依赖于抗原蛋白正确折叠所形成的三维空间构象。表显示各种抗体的优缺点。抗体的选择 多克隆 ...

本底高和非特异性条带可能是由于抗体制剂中存在与印迹膜上其它蛋白质结合的抗体（非特异性抗体）。对于免疫印迹来说，理想的抗体应是仅能特异性识别待测抗原，但实情并非如此，印迹膜上总会出现一些额外的条带。这些条带的来源一般有两种：一种是由于制剂中存在的非特异性抗体产生的背景条带，另一种则是由于特异性抗体与含有与待测抗原类似表位的多肽发生的交叉反应。 动物抗血清中含有 ...

用荧光素标记抗体，下面介绍直接法和半透膜法。

对于化学发光检测系统和多数抗体制剂来说，检测最低值可达到约2 fmol/L（10-15）的水平。相当于0.1ng 的50 000kD的蛋白质，高于此浓度的样品较易检出。一个标准的SDS �聚丙烯酰胺凝胶泳道的上样量为150µg（小胶道可为15µg），如果上样量过大条带会发生扭曲变形。因此，50kD中等大小蛋白抗原的上样量以0.1ng/150µg（或1/15 000 0 ...