细胞技术

问： 手上有U251细胞，pEGFP载体，现在将不带外源基因的载体转u251的效率都很低，10%都没有。 所用转染试剂：invitrogen的Lipofectamine 2000和威格拉斯的Vigofect，效率都很低，试过不同细胞密度，不同的DNA和转染试剂的比值，还是不行。 各位高人有没有什么建议，另外转染的时候使用有血清的培养基养细胞，不知道影响大不大（说明书上说没有影响），稀释DNA和转染 ...

华之风问： 请教园里战友，本人拟用siRNA转染做平滑肌细胞，观察基因沉默后效果的，但是我们实验室环境不太好，细胞培养容易污染，想加双抗，但不知道加双抗对基因转染沉默有无影响，谢谢！ 丁香园网友hainblue认为： 有影响的，以前用脂质体转染的时候，说明书上说的是转染时不要用含有抗生素的培养基。他的解释是可能引起细胞死亡。具体怎么样就不知道了，比较试剂很贵，没钱作者方面的尝试。 丁香园网友lau ...

问： 最近要做稳定转染了，但不知道如何配制G418，有一些细节想问问大家，我打算用PBS来配，我想问问是用高压过的PBS来配，还是用未高压的PBS配，配完了是不是要过滤，然后放到-20保存，用的时候是不是放在4度.请各位来帮我解答一下，谢谢. 答： 我实验室的师兄一直是用HEPES配制的，因为PBS对细胞的损伤会大一些。 配的时候就是用配好的HEPES溶G418，然后过滤，不用高压灭菌了，配好后分 ...

问： 现用免疫磁珠（美天妮）分选cd4＋和cd8＋T淋巴细胞，效果不是太理想。单个核细胞2×106，分离出cd4＋只有1×105个，buffer等试剂都没有问题。不知道还有什么地方没有注意到，希望各位战友指点？ 答： 呵呵，我也用美天妮分离CD14+单核细胞，结果还不错。 分出的细胞占单个核细胞五分之一。 我是根据说明书进行操作的，觉得以下几方面比较重要： （1） ...

问： 配制苏木素染料所用的氧化汞一般用白氧化汞还是黄氧化汞？ 答： 苏木红的产生需经氧化才能获得，获得苏木红有两种方法，其中一种是加入黄色氧化汞促进成熟，期间的注意事项： ①苏木素一定要预先溶解，否则较难彻底溶解。 ②加入黄色氧化汞后，可产生大量的气泡，因此，配制500ml的溶液，一定要选择2000ml以上的容器，否则液体便会溢出。 ③当溶液变为深紫色后，应终止氧化，烧瓶应直接插入冰水中， &nb ...

问： 我现在用做逆转录病毒包装，先要建立包装细胞，想问大家一下，Invitrogen公司有两种脂质体，Lipofectamine 2000和lipofectin，要进行稳转的话，是用哪一种啊，见有人说Lipofectamine 2000用于瞬时转染效率最高，lipofectin主要用于Stable transfection，不知道对不对啊？ 同时做稳转的质粒有什么要求啊？必须是用无内毒素的吗？ 答 ...

xuliang问：我现在做的课题需要向细胞中转染Foxp3基因，然后把转染后的细胞注射至小鼠体内。看介绍说脂质体有毒性，会引起小鼠发生肺炎。我是刚开始接触转染，对转染还不熟悉。请教各位高手，象我这种情况最好使用哪种转染方法，转染后的细胞注射至体内后对小鼠的毒性最小。万分感谢！ 丁香园网友ggppllzzww认为： 脂质体对小鼠有毒性，细胞并没有。 直接把转染过脂质体的细胞，通过小鼠尾静脉打进去就可 ...

简单的步骤！ Co-IP： 1.resuspend pellets in 100µl EBC-buffer 2.take 20µl for Input control，+ 7µl put at -20℃4x sample buffer and boil 6min at 100℃ 3.add 400µl EBC-buffer and incubat ...

问：cos-7的转染 1、细胞的培养：我们在培养细胞时发现该细胞长的很快，不到2天的时间就长满了；消化的时候老是成块的掉，如果消化时间加长，细胞也能成单个的，但是细胞的生长力又减弱了，请问要怎样来克服这一问题呢？ 2、转染前：转染前16-24h我们用含血清不含抗生素的MEM传进6孔盘，16h左右就发现细胞贴壁了，但是形态没有以前好，并且漂死细胞相当多。最初我们都以为是细胞没有贴壁，又把细胞放进培养 ...

xiaoniao175问： 请问怎样提高细胞的转染效率？我前天做了转染，连接目的基因的载体带荧光，转染后４８小时在荧光显微镜下观察，却发现只有约百分之１５左右的荧光，我该怎么提高转染效率？有没有必要接着往下做筛选？还是重新转染一次？ 丁香园网友dafang0212认为： 如果要是做稳定筛选的话，15%的转染率应该够了。 提高转染效率的话，可以适当降低转染时细胞的密度（我试过60～70%的密度比90 ...

问：细胞稳定转染建系后，转染的质粒细胞内本身有较高表达，我的质粒是点突变的质粒，我做的是稳定转染，按理论稳定建系后不应该对细胞增值有影响的。 根据实验设计，我往已经稳定建系的细胞中，再瞬时转染了带报告基因的另一种质粒，同时往野生型即没有转染任何质粒的细胞中也同时转入了相应报告基因质粒，两者相比稳定转染的细胞系转染效率与野生型相比明显低了几百倍。报告基因的读值一个为20几万，而稳定建系的只有几万，相 ...

Homo sapiens baculoviral IAP repeat-containing 5 （survivin）（BIRC5），transcript variant 1： 1 atgggtgccc cgacgttgcc ccctgcctgg cagccctttc tcaaggacca ccgcatctct 61 acattcaaga actggccctt cttggagggc tgcgcct ...

问： 哪位高手给分别指点一下脂质体和质粒转染的具体过程！ 答： 具体过程都大至差不多，一管混匀质粒，另一管混匀脂质体，脂质体混匀后过几分钟，逐滴加入混匀的脂质体，温柔混匀。但是我想更为重要的有二个方面，一是你用的哪一公司的脂质体，然后查阅其产品说明书，可能不同的公司的脂质体所用的溶剂是不一样的，具体按说明书进行操作；第二是查阅你所要转染细胞的转染密度与大致转染效率如何，便于以后分析问题。 ...

ayao0问：转染的时候可以用加血清的培养基吗 前几天学习做细胞脂质体转染，看师姐是用的加血清的培养基，整个过程比以前的方法简单方便了很多。 不用过四个小时就去换液，可以过了48个小时看转染效率很不好，以前也有人用这种方法做过，很成功。 到底这种新的方法行不行的通，做的时候需要注意哪些问题 丁香园网友monica912认为： 这种方法是完全可以的，我经常这样做，没问题的。 只是转染后最好4~6小时 ...

1ml RIPA buffer contains 35μL proteinase inhibitor(sigma cat no P8340) and 10μl phosphatase inhibitor RIPA buffer 最终浓度 1M Tris-HCl pH7.5) 5 ml 50mM NaCl 0.87g 0.15 M Na-deoxycholale 0.1g （1%） 0. ...

Apoptosis-DNA ladder Assay 1. Collect c μlture media add 1 ml of trypsin to cell mono1ayer on 100-mmol/L dishes scrape the cells harvest cells (c μlture media and cell monolayer) by centrifugat ...

问：刚买了南京建成的LDH试剂盒，打算用酶标仪检测细胞的LDH释放率，但是有几个问题比较困惑？ 1、用96孔板种细胞，密度应该种多大？ 2、细胞培养液应该加多少？用1640会影响OD值的测定吗？是否应加上单独培养液作为对照呢？ 3、测上清液的LDH时，应该取多少作为样本呢？ 4、超声破碎细胞时，需要破碎多长时间？ 5、因用96孔板检测，可否将说明书中的液体用量减到1/10？这样会对结果有影响吗？ ...

问：我提取的是贴壁细胞蛋白，过程是1、PBS洗2遍后，细胞刮刮下后离心（没有消化，这样可以吗？）2、去上清，每管加入了加了188微升的裂解液和12微升的PMSF（是不是太多了？）。3、离心后，吸取140微升上清到新EP管中。4、加入5×sds上样缓冲和DTT（请问，这一步的我的比例应该是多少？我是上清：SDS:DTT=7：2：1。）今天跑胶后，考马斯亮蓝染色发现，条带淡到要靠想像才能看 ...

问：最近准备分析RNA的表达水平，园子里有人是从组织里面提取，有人从血液提取，想问的是，对于同一个人，这两种提取方法有什么区别吗，两种方法RNA的提取量有区别吗？ 答：血液里面提RNA比较麻烦，量也少，前期处理如下： 1、无菌采集静脉血2 ml注入盛有2 ml Hank’s液（含100 u/ml肝素）的试管中，混匀。 2、吸取淋巴细胞分层液2 ml加入离心管中，再将稀释抗凝血液小心沿管 ...

DXY网友qingraner提问：本人核浆分离做了最少两个月了吧，似乎没有什么进展，我想请问高人指点一下。我很想知道我的配方有什么问题，或者是我的操作有什么需要注意的地方。十分感谢！还有，我检测的方法是用Ikb-α（标细胞质）和Oct-1（标细胞核），似乎抗体也不是很好用。我做的是BT474细胞，breast cancer cell。 我的方法如下： 1、用Buffer A 洗涤 2、 ...