细胞技术

问：最近的一个实验困扰我许久，就是关于给药剂量的问题，具体如下： 我在培养瓶中按undefined10E6密度观察了心肌细胞的搏动和药物的干预情况，接下来想做MTT，需要用96孔板做，是否还需要保持原来的密度，或可以降到undefined10E5呢，希望高手指点， 答：1.给药剂量需要预实验摸索，可以用6孔或24孔板实验，按照倍比或10倍浓度梯度设计不同剂量组，观察药物量效关系，最终再选择合适的浓度或更合理的浓度梯度进行下一 ...

NIH3T3细胞中本身是没有TK的，1981年Scolnick利用lambda载体把胸腺嘧啶激酶（TK）转入NIH3T3细胞，构建成NIH3T3 TK细胞，所以细胞分为NIH3T3 TK＋和NIH3T3 TK-两种细胞，在Scolnick认为NIH3T3就是NIH3T3（TK－）。 他做转染细胞的基础是基于1969年Todaro的实验。 具体内容参看建株文献：J Virol.1981 Septem ...

问：目的蛋白7kd，筛了稳定株，可western检测不到，因为电泳时marker也跑得不好，因此不能确定是假阳性。 载体上带了myc tag，不知做免疫荧光来检测是否可行？谢谢 答：原理上可行。如果免疫荧光对你来说比wb更熟练的话，你可以选择用荧光来检测。反之，还是用wb检测，再把实验尽量做得好一些。用wb的话，可以用你target蛋白的特异性抗体，也可以用anti-myc的抗体，最好两者都做了， ...

问： 这几天做293细胞的脂质体转染，为腺病毒的包装阶段. 用最小的培养瓶（好像是25ml的），加入脂质体10μl，pacI酶切纯化物8μg 进行转染.细胞最密处为80-90%，大部分为60%左右. 48小时后，1/3的细胞漂起来，但有荧光出现.4天后漂起来一半，最密处的视野见20个左右的荧光.以前细胞相对稀疏的地方，仅有很少的细胞还附壁，完全无法见到荧光，即除开原先细胞较密的一小处外 ...

问： 构建逆转录病毒为载体的DNA（质粒），阳离子脂质体2000（过期的），转染病毒包装细胞pt67，G418筛选，在换液和传代过程中均会有细胞死亡（贴壁细胞漂浮）。求教原因。 换液3.6ml DMEM+0.4ml新生牛血清+24μlG418 传代用胰酶ph 7.2，1ml，用0.3ml新生牛血清中和，800rpm离心5min，弃上清，加入上述培养液。 答： 做一下G418浓度筛选，另外你的 ...

丁香园网友fxlys412： 我是刚刚开始接触实验的，对很多东西我都不太懂。所以想请教下各位达人。 我的问题是：要将一外源性基因转染PC3细胞，然后观察抗肿瘤药物对细胞的凋亡影响。 我现在不知道如何下手，是用腺病毒转染还是脂质体呢？该如何选择？ 丁香园网友jollyyyhan认为： 两个都可以啊，我经常用的是脂质体，效率还是蛮高的。不过据说瞬时表达效率高，稳转的好像病毒载体要好筛选一点呢 丁香园网 ...

问： 想请教各位：我在转染后要挑克隆，现在不知道该怎么做？我是在培养瓶中养细胞，现在用Ｇ４１８杀之后，克隆已经形成，且克隆间间距较大，如果要挑克隆该怎么做呢？谢谢！ 答： 可以用滤纸片消化法对单个细胞岛进行消化。可以根据细胞岛的大小，裁滤纸片的大小。灭菌后使用。 ...

有限稀释法的程序 ①制备饲养细胞悬液 ②转染了重组质粒后的细胞计数，并调细胞数在1～5×10３/ml ③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100μl/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液 ...

问： 各位好！我现在在大鼠脑组织的mRNA的原位杂交，测BDNF，DAB显色的时候有淡黄色，但是复染之后就是满视野蓝核了，只有零星的阳性结果，并且据文献报道以神经元阳性细胞多见，但是我是胶质细胞的阳性多于神经元，几乎神经元都没有阳性细胞。我用的是地高辛标记的寡核苷酸探针，是天津灏洋的，我的试验流程如下：1.二甲苯两次，10分钟每次，100%、90%、80%酒精各一次，每次10分钟。2.打孔液室温1 ...

sjelly：我的CEF在接了马立克病毒后，一直没有病变出现，于是盲传了3代，还是没有病变，但是每一代提基因组还能P出病毒的条带来，而且很亮。我接了3批不同时间冻存的病毒，其中有两批是以前出过病变的，但是现在不知道为什么变这样了，是哪里出了问题啊？ 丁香园网友bjzhaohong3认为： 不知楼主接种病毒病变时改变血清浓度没有，我们养细胞时血清是10%.而稀释接种病毒时血清浓度是2-3%. sje ...

wo4haoren：，小弟正在用G418筛选单克隆，用的是平皿，一个平皿长了大概几百个吧，但是怎么把单克隆消化，转板呢? 没有想到好的方法，想定点消化，发现胰酶会很快扩散，消化到其他克隆，很郁闷，有做过的大侠交流下经验，不胜感激！ 丁香园网友cmingwen认为： 可以用枪头或者是无菌的东西把单克隆刮下来，再放在孔板培养，应该可以！ 丁香园网友xinyinhancidian认为： 一般是用克隆环， ...

转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型（对于困难的细胞系尤其如此），需要被转染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质），转染试剂等。但无论在何种情况下，转染的成功均取决于转染效率、低细胞毒性以及重现性这几个要素。 细胞： 分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。同样重 ...

xunmixm问： 请教有经验的网友们，我利用重组后的腺病毒感染原代培养的小脑颗粒神经元，转染率在5%左右，但是发现凡是转染进去GFP的神经元全部死亡，（而转进GFP的杂质细胞－如胶质细胞状态良好），神经元表面好像桑葚状，感觉要碎掉了，有的漂起来，看不到有GFP标记的神经轴突。 请教如下问题： 1.造成上述神经元死亡的原因是什么呢？ 2.如何提高腺病毒的转染率？可能我的病毒滴度还不够高。我的操作是 ...

1.应该是可以的，但是脂质体2000的细胞毒性的确比较大，如果细胞比较敏感的话不建议使用。罗氏的FugeneHD细胞毒性比较小，而且效率也高，特别是对原代细胞，肿瘤细胞和干细胞。悬浮细胞的话还是电转吧。 2.可以，用脂质体2000转染Hela细胞，没感觉对Hela细胞毒性大，而且转染效果在70%以上。有过在转染过程中要注意边加入边摇晃液体，以免脂质体2000对局部细胞产生毒性作用。 ...

geniusma问： 准备做hepg2的转染试验了，实验室常用的的是lipofectamine 2000，听说hepG2的转染效率很低，并且这种细胞比较容易成团，这会影响转染效率吗？是否用trypsin+EDTA可以使其成为单个细胞不成团？哪种转染方法更适合hepg2?需要改用电转吗？如果用lipofectamine 2000，加入的比例如何?请有经验的朋友告知详细情况，谢谢！ 丁香园网友star ...

腺病毒可以在293A细胞中进行转录，表达并可进行包装复制出大量高滴度病毒。293T是一种逆转录包装表达细胞，我做过也可进行表达，但还没有具体鉴定表达后的病毒是否可用。 293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒（Ad 5）DNA的永生化细胞，表达转染的腺病毒5的基因。 细胞来源都是人肧肾上皮细胞，293T细胞表达E1A蛋白，SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。293F ...

问： 各位园友，本人今天刚刚做了转染，用的24孔板，质粒是带有荧光的（含neo基因的载体），如果转进去了，下一步就要进行筛选？但是不知道具体该怎么做才能得到稳定转染的细胞？ 答： 最好先做以下预实验，摸一下G418的浓度范围，以未转染的细胞做对照，当未转染细胞完全杀死作为最佳筛选浓度。在选择压力下待存活的细胞逐渐形成小克隆后可以传代，随后可以逐步降低G418浓度至原使用浓度的一半作为维持压力。这样 ...

zhangcy2004问： 细胞转染后建立稳转细胞系大多用G418来杀，可是这种抗生素的选择是根据什么来确定的呢？还可以用其他的抗生素吗？ 如果一个载体上有两个抗生素基因，氨苄青霉素和新霉素，那么建立稳转细胞系时该用哪种抗生素来杀细胞呢？刚结束这方面的知识，不甚了解，恳请高手指点迷津！非常感谢！ 丁香园网友alfredyu2004认为： 虽然我也是不是太清楚，但是应该看转染是细菌还是细胞 氨苄青霉 ...

Principle and method： NADPH-dependent O，- generation was measured using the tetrazolium dye NBT as an electron acceptor.NBT is rapidly converted to monoformazan by two molecules of 02-.This reduction ...

乡乡问： 最近本人在做HepG2细胞的转染，转染的是GFP质粒，按照LIPO2000的说明书使用后，发现细胞的死亡很严重，24h时差不多死了一半。而且我在转染前细胞密度差不多达到90%，也在转染后6小时的时候换了培养基。在显微镜下看荧光的转染效率大概有70%－80%，虽然效率还可以，但是由于细胞死亡对我后续的实验有影响，所以在此请教各位高手，如何才能使细胞不死，或有说明实验室对于HepG2的转染有 ...