蛋白质技术

蛋白转运过程可以形象的描述为成千上万的蛋白质在一个细胞内按照有序的方式移动，就像街道和高速公路上的车辆，每一个细胞中的蛋白质被合成后都有它自己的目的地。质膜蛋白（PM）转运是所有蛋白转运过程中的重要组成部分。质膜是胞浆和细胞外环境之间的交界面，细胞骨架是细胞运输机制的一个重要组成部分，比如囊泡和内涵体在肌动蛋白微丝或微管上移动。从质膜将蛋白转运到其他位置或者将蛋白转运到质膜的过程很大程度上与蛋白本身细胞器 ...

Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。为利于更好的实验效果，不同蛋白，转膜条件略有不同，迪申生物技术（上海）有限公司专注于生产免疫组化相关产品多年，对 WB 实验有一定了解，今天跟各位同学一起分享下实验过程中发现的不同蛋白的转膜条件。蛋白来源：RAW264.7 总蛋白蛋白名称：一些转录因 ...

Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。WB 实验中常会出现各种问题，迪申生物技术（上海）有限公司专注于生产免疫组化相关产品多年，对 WB 实验有一定了解，今天跟各位同学一起分享下 WB 实验中各种问题及应用对策。问题可能原因建议电泳条带成笑脸状胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高减少电 ...

羧肽酶 B (EC 3.4.17.2) 专一用于蛋白质 C-末端碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）的水解；又称为肽酰-L-赖氨酸（L-精氨酸）水解酶；精蛋白酶。分子量为 35kD，等电点为 6.0，最适 pH 为 7-9。羧肽酶 B 是抗体碱性峰检测的特异酶，通过比较酶切前和酶切后的图谱来计算抗体碱性变体的比例，对于抗体的发酵工艺和纯化工艺稳定性的控制都具有重要的意义。而在抗体碱性峰的检测中，没有完全统一的标准，如酶解缓冲液酶的用量，酶解时的温度和时间等。而这些与酶的性 ...

羧肽酶 B (EC 3.4.17.2) 专一用于蛋白质 C-末端碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）的水解；又称为肽酰-L-赖氨酸（L-精氨酸）水解酶；精蛋白酶。分子量为 35kD，等电点为 6.0，最适 pH 为 7-9。羧肽酶 B 是抗体碱性峰检测的特异酶，通过比较酶切前和酶切后的图谱来计算抗体碱性变体的比例，对于抗体的发酵工艺和纯化工艺稳定性的控制都具有重要的意义。而在抗体碱性峰的检测中，没有完全统一的标准，如酶解缓冲液酶的用量，酶解时的温度和时间等。而这些与酶的性 ...

若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：1．用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间；2．将膜在 PBST 或 TTBS 中洗涤 30 min 或更长，期间至少换 2 次液；3．封闭 40~60 min；4．一抗杂交，室温 1 h。37℃ 1 h 会更强，但可能增加非特异条带；5．PBST 或 TTBS 洗膜 20 min，期间换 2 次液；6．二抗杂交，37℃ 1 h；7．PBST 或 TTBS 洗膜 20 min，期间换 2 次液；8．发光鉴定；9．若条带仍未出现或很淡，可以再用 PBST 或 TTBS 洗涤膜 20 min，期间换 2 次液；10．三抗杂交 ...

一般使用辣根过氧化物酶 HRP-ECL 发光法或碱性磷酸酶 AP-NBT/BICP 显色法。1．HRP-ECL 发光法：将 A、B 发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于 A、B 混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5 min 左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中 1-2 min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定 Marker，进行 ...

封闭及杂交在做杂交时，个人建议：还是使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育，这样节约抗体。操作开始：1. 将膜用 TTBS 从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭 1 h。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和 TTBS 将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白 marker 则可省略此步。2. 将一抗用 PBST 稀释至适当浓度（在 1.5 ml 离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保 ...

转膜篇1. 转一张膜需准备 6 张 7.0～8.3 cm 的滤纸和 1 张 7.3～8.6 cm 的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸 2 h 才可使用。要领：（1）用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水；（2）个人感觉其实转膜之前浸湿一下就 ok 了，没有多大问题，可能按照上述操作结果会更好。2. ...

电泳篇开始一、清洗玻璃板一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。二、灌胶与上样1. 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。注意：可以用 1% 琼脂糖在垂直电泳槽的左. 右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶。2. 按前面方法配 10％ 分离胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用 10 ml 枪吸取 5 ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一 ...

一、单层贴壁细胞总蛋白的提取：1.倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2.每瓶细胞加 3 ml 4℃ 预冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4.每瓶细胞加 400 μ 含 ...

WB 实验在提取完蛋白质后，就要对蛋白含量进行测定测定方法如下：一、制作标准曲线1、从-20℃ 取出 1 mg/ml BSA，室温融化后，备用。2、取 18 个 1.5 ml 离心管，3 个一组，分别标记为 0 μg，2.5 μg，5.0 μg ，10.0 μg ，20.0 μg ，40.0 μg。3、按下表在各管中加入各种试剂。4、混匀后，室温放置 2 min。在生物分光光度计上比色分析。二、 检测样品蛋白含量1、取足量的 1.5 ml 离心管，每管加入 4℃ 储存的考马斯亮蓝溶液 1 ml。室温放置 30 min 后即可用于测蛋白。2、取一管考马斯亮蓝加 0.15m ...

破碎大量样品、低温破碎大量样品、破碎坚硬或韧性较强的样品时，人工手动研磨就成了实验猿的噩梦。当然，也有很多实验猿已经尝试过市面一些研磨机/超声波粉碎机，发现自己那顽固的样品依然无法被完全破碎/破碎过程损坏了目标成分而十分心塞。特别地，一些尤其坚硬/韧性比较强的样品，或要求维持低温条件进行破碎提取的样品，需要结合液氮进行研磨，如：皮肤、硬骨骼、软骨、血管、结缔组织、种子等；使用普通机械研磨方法，很难既保证研磨破碎效果又保 ...

Western Blot 又称为蛋白质印迹，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的基于抗体抗原之间特异免疫反应的一种定量或定性检测蛋白的实验方法。其基本原理为：聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同分子量的蛋白质样品分离，分离后的蛋白被转移到固相支撑物（杂交膜）上，抗体特异性识别目标蛋白，通过酶促反应或者化学发光等方法将目标蛋白可视化，从而对蛋白进行定性或者定量研究。「良好的开始是成功的一半」，尤其对于生物学实验，如果没有高质量 ...

免疫印迹（Western Blotting）的基本原理及应用免疫印迹是一个用于蛋白质分析的常规技术，在电场的作用下将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物，然后利用抗原-抗体的特异性反应，从蛋白混合物中检测出目标蛋白，从而定量或定性的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况。Western blotting还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析，作为一种廉价、便捷、可靠的研究工具，将 ...

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。蛋白质印迹法（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物 NC 膜或 PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检 ...

Western Blot 又称为蛋白质印迹，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的基于抗体抗原之间特异免疫反应的一种定量或定性检测蛋白的实验方法。其基本原理为：聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同分子量的蛋白质样品分离，分离后的蛋白被转移到固相支撑物（杂交膜）上，抗体特异性识别目标蛋白，通过酶促反应或者化学发光等方法将目标蛋白可视化，从而对蛋白进行定性或者定量研究。抗体与抗原之间的特异性识别是 Western Blot 实验中最为关键 ...

无论是保存还是运输，请避免反复冻融。反复冻融，冰晶会破坏抗体和重组蛋白的空间结构，导致蛋白变性形成多聚体和重组蛋白构象改变，从而降低抗体的结合能力，也加快了抗体球蛋白和重组蛋白的降解速度。抗体和重组蛋白保存得当与否，直接决定了抗体和重组蛋白的活性使用效果，如果保存得当，Immune tech（苏州杰恩生物）的抗体和重组蛋白活性大部分都可以维持数年。1. 收到抗体和重组蛋白后的操作收到抗体和重组蛋白后（大部分抗体和重组蛋 ...

Western 荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压 10~30s，看不到则同时压两张，10~30 min 洗一张，如果无则再补一张,1 h 后洗。再无，则压过夜。共 3 张片，根据每次结果调整。其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长 2~3 厘米的片子（以供贴胶带），然后剪 2 片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使 ...

yzzaici888 大家好，本人最近一直在做p-p38的磷酸化，但是一直都做不好。希望各位大侠帮助解决：蛋白上样量80-100ug，半干转膜70min，5%BSA封闭70min，一抗CST（#9211） 1：500加，4℃孵育过夜，二抗1:8000加室温70min。曝光出的结果很不好，杂带很多，也分析不出那条是目的条带，且没有趋势，见下图15001046419 1、上样量80-100太大了，但条带出来很浅，是不是定量有问题或者抗体有 ...