PCR技术

The following colony PCR protocol has been designed to be performed in individual reaction tubes. We usually test three colonies from each transformation along with a wild-type control. A series of fi ...

Description Single primer PCR allows amplification from known to unknown regions in chromosomes phage plasmids large PCR products and other sources of DNA. At sufficiently low stringency any primer wi ...

1、反应体系 25ulCocktail 20 ul: Primer FP 1 ul + Primer RP 1u + 2 * SYBR GREEN I MIX 12.5 + H2O 5.5 ul cDNA 5 ul 2、Primer 浓度，需要摸索，从200nM到700nm等，设置不同浓度。 3、每个引物浓度，从well 1到12设置4个样本，阳性cDNA 1和2，NTC以及H2O，做tripli ...

Q: Does the PCR reaction volume (negatively) influence the outcome? A: No especially since the introduction of the small thin walled 0.2 ml plastic vials fitting the 96 well metal blocks of the thermo ...

After an aliquot of the PCR mixture is analyzed on an agarose gel the remainder of the reaction is concentrated by ethanol precipitation resuspended in buffer and subjected to a simultaneous fill-in/k ...

"Hot Start" PCR: In certain circumstances one wishes to avoid mixing primers and target DNA at low temperatures in the presence of Taq polymerase: Taq pol is almost as efficient as Klenow po ...

Recommended Reaction Conditions: Initial Conditions: Initial denaturation at start: 92 - 97oC for 3 - 5 min. If you denature at 97oC denature sample only; add rest of mix after reaction colls to annea ...

PCR和RT－PCR常见问题及解答 ...

标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 　 10ul 4种dNTP混合物 　 各200umol/L 引物 　　　　 　 各10～100pmol　& ...

1、引物 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则：　　①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。　　②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。　　③引物碱基：G+C含 ...

一、聚合酶链反应的历史回顾 1、核酸体外扩增最早的设想 由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基 因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了 DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人 们遗忘。 ...

聚合酶链反应即PCR技术，因为其对基因或特定核酸序列在短时间内的极大的扩增效率，已在感染性疾病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、法医学、动植物和考古等的诊断和研究中得到了广泛的应用，并在某些方面几乎是难以替代的。但是，像自然界的任何事物一样，PCR也有其局限性，稍不注意，就很容易造成错误的判断。 感染性疾病由病原微生物引起，主要有病毒、细菌、衣原体、支原体和螺旋体等，在PCR出现以前，这些病原体通常采用培 ...

1、基本要素和扩增原理 基本要素与DNA复制的基本要素是一致的。待拷贝的 DNA 称为模板，它可以是双链 DNA 也可是单链DNA，最后扩增得到的产物是双链状态的。引物是 DNA 复制的先锋，就象结晶过程中的晶核，引导 DNA 的合成。在 PCR 扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。DNA 聚合酶是 DNA 复制的动力，在 dNTP 等底物存在时在引物的引导下沿着模板 DNA 合成互补的 DNA ...

PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。这时改变已知对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。 1、降落PCR 降落PCR代表了一种完全不同的PCR优化方法，它 ...

PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带　 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多 ...

PCR技术的发明 1983 Kary Mullis 发明 1985 开始有文章发表 1993 获诺贝尔奖 广泛用于分子生物学研究领域 变性--退火--延伸三个步骤 1、模板DNA的变性：93℃-95℃左右 2、模板DNA与引物的退火(复性)：Ta=Tm-3~5 ℃ 3、引物的延伸：Taq DNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活 ...

问题1：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无 原因: 1、模板:含有抑制物，含量低 2、Buffer对样品不合适 3、引物设计不当或者发生降解 4、反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策: 1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2、更换Buffer或调整浓度 3、重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4、降低退火温度、延长延伸时间 问题2：非特 ...

Troubleshooting for PCR and multiplex PCR Troubleshooting discussion is based on the PCR protocol as described in the table below. All reactions are run for 30 cycles. COMPONENTVOLUMEFINA ...

PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及，PCR循环条件。 寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。 ...

Possible Causes: Components · Primer concentration is too low. · Primer concentrations not balanced. Make sure primers arepresent in equal concentrations. · New primers are requir ...