PCR技术

PCR基本原理： PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构 成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结 合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降 ...

Mullis博士在发明PCR技术后曾这样描述：“用一个单分子DNA，PCR能在一个下午内产生100百万个相似的分子。反应很容易进行，只需要一个管子、一些简单的试剂和一个用来加热的设备”（Beginning with a single molecule of the genetic material DNA the PCR can generate 100 billio ...

对于PCR实验来说，如何在得到理想的扩增产物的前提下尽可能加快反应进度、缩短反应时间是每个PCR实验人员关心的热点。下面我就这一问题谈谈自己的看法，以便抛砖引玉。 PCR实验所耗的时间大体上可分为三个方面：模板制备、PCR加样与上机反应、反应后的电泳检测和拍照。 一．模板制备 对于模板制备阶段，尽量缩短模板提取时间既有利于缩短整个PCR反应时间又可以尽可能的减少模板降 ...

PCR仪器发展的趋势之一变得更加微型化， PCR芯片就是在这种趋势下诞生的。PCR芯片就是在微型的载体上进行PCR反应，是微型化的PCR仪。芯片PCR不仅节省了大量反应试剂因此降低了实验成本，还有助于提高反应速度。下面就让我们回顾下PCR芯片的发展历史： 早在1994年Peter Wilding等人就通过在硅表面蚀刻的三维小室放入PCR反应物，然后通过半导体加热制冷片控制温度，扩增 ...

总的说来，荧光检测技术可大致分为两大类：通用型的荧光染料检测法和高特异性的荧光探针 法。前者主要是利用荧光染料(如SYBR Green I)与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，优点是：无需另外设计荧光探针 ，无需特别优化条件，简便易行，成本较低，能适用于任何一款定量PCR仪，缺点是专一性不如探针法；而后者则利用荧光标记的特异性探针或者引物来识别模版，优点是特异性更高，适用于扩增序 ...

1. 当PCR结果不满意时考虑以下几个方面 (1)将PCR反应的试管与反应板紧贴 (2)使用50ul或更少反应体系时勿使用AmpliWax两个反应混合液=的操作方式在大多数情况下很有效 (3)当酶反应混合物以70度"热启动"开始循环时切记在加入酶后稍微振荡一下因为在0.2ml的PCR管不能均匀传热. (4)不要随意减少dNTP的用量必需与其他成分保持平衡. &nb ...

我做不出来克隆的时间长达半年，期间克隆实验方面许多问题都遇到过，现在总结主要的一些问题和大家交流，希望大家以后不要犯我一样的错，少走弯路。 1、感受态细菌本身有质粒污染，这个问题困扰了我三个月，一直到最近才找到原因，我这里犯了最大的错是没有做过感受态检测。也许大家奇怪为什么在三个月内的时间里没有怀疑到感受态，不用奇怪，因为感受态“表现的太正常了”，每次涂板都 ...

一、样品准备区 这个区域专门用作样品的准备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采。 取预防措施： 1. PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。 2. 组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理，以根据应用的需要提取DNA或RNA。 3. 用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序 ...

一、亚硫酸氢钠修饰过程中可能出现的问题及应对措施 亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5-甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致MSP扩增失败，体会如下： (1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3.0～3.9 mol/L为好，其pH值必须用NaOH精确调整至5.0 ...

一、基因组DNA的提取。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1. 蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20 mg/ml； 2. RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10 mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消 ...

DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断，符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6~1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。 一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得，你可以自己算一下OD260/OD280，如果在要求的范围内，说明你的OD320偏高，即可能有有机物污染，比如酒精未充分挥发。 纠正一下，纯DNA的A260/A ...

一、总RNA的提取 总RNA的提取方法多种多样，目前常用的酸性异硫胍一步法、Trizol法和使用标准RNA分离试剂盒。抽提的关键是尽量减少RNA酶的污染，为减少假阳性，相比较的样品在同一条件下应用同种方法同时抽提，抽提的总RNA在反转录前必需经过脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）充分消化，可设立不加反转录酶的对照来检验DNA是否被去除。紫外分光光度仪测其纯度，甲醛变性凝胶电泳测其完整性，28sRN ...

巢式PCR的定义 巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通 PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增。巢 式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢 ...

免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验（ELISA）的测定过程；第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中，首先用待测抗原（如牛血清白蛋白（ESA））包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素（Protein A-Streptavidin）嵌合体（重组融合蛋白）中的 ...

PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。这时改变已知对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。 1. 降落PCR 降落PCR代表了一 ...

一、污染原因 1. 标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。 2. PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水 及其它溶 ...

一、增加PCR的特异性 1. primers design 这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件 （1）足够长，18-24 bp，以保证特异性。当然不是说越长越好，太长的引物同样会降低特异性，并且降低产量。 （2） GC% 40%-60%。 （3）5'端和中间序列要多GC，以增加稳定性。 （4） 避免3'端G ...

1. 问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 可能原因： （1）RNA被降解 建议解决方法： 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA； 在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA； 如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在&g ...

1、PCR产物的电泳检测时间？ 一般为48 h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48 h后带型不规则甚致消失。 2、假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色 ...

PCR基础 聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表1）。 模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化 ...