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        PCR反应仪器、耗材的重要性

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        PCR基本原理:

        PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构 成:

        ①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结 合,为下轮反应作准备;

        ②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结 合;

        ③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对 与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。

        每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因 扩增放大几百万倍。

        反应条件一般为:

        变性温度和时间 95℃,30s

        退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃

        延伸温度和时间 72℃,1min/kb(10kb内)

        Tm值=4(G+C) +2(A+T)

        循环次数 :一般为25 ~ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低,可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右,循环数超过30个以后,DNA聚合酶活性逐渐达到饱和,产物的量不再随循环数的增加而增 加,出现了所谓的“平台期”。

        PCR反应中耗材和仪器的重要性:

        因PCR反应的精密度,使得在此过程中,耗材和仪器的辅助作用非常重要,如Tip的准度和残留度;PCR tube的密封性及热敏感度;所有耗材的外源DNA/RNA酶以及细菌的污染程度;以及在此过程中仪器使用的便捷度等,都是我们要考虑的因素。所以选择合适的耗材也是实验成功和便捷的重要因素。

        PCR相关耗材:

        10ul/200ul tip

        10ul/200ul 枪头掀盖盒

        8连排PCR tube 100ul/200ul

        12连排PCR tube 100ul/200ul

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