PCR技术

我最近合成了几十对引物，，在实战中多多少少有些心得，拿出来给大家分享。我感觉想把引物合成的比较好，除了前引物和后引物的Tm不能相差太大，我们还要重点考虑以下因素：一、GC% GC含量对于PCR反应来说GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适；而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。产物中GC含量最好大于引物中的GC含量。二、Degeneracy 多义性当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的 ...

qPCR的数据相对定量分析其实很简单。我做了很多的qPCR实验，也看了很多的资料，包括Nature protocol， AB官方的分析教程，MIQE，甚至包括一些商业化软件使用的教程及教程里面记述的原理。我在这里跟大家分享一下自己的经验，最常用，最普遍的相对定量方法就是2^-△△Ct法，该法最最简单的说就是：首先将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值，得到的数就是△Ct ...

各位大侠好:我是这里的新成员,也是做PCR的新手,我想问一下,如果我知道了一个基因的全长,如何设计出合理的特异性很好的引物.我要做的是RT-PCR,现附上我所要用的基因全唱,不知道是不是需要.1 gaattccggc cgctggaatg ttgtgtgaac tttgctctcc gtctattctc tgatttgtca61 agaaaagcca atcaaccaat agctgaggag agaagagctg gacttctgat tctaggga ...

一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。这样，可保证在将来扩增时 ...

1．材料和方法Access RT-PCR System 试剂盒 (A1250)：Promega 公司产品。500u AMV Rev 目的基因 se Transcriptase, 5u/ul500u Tfl DNA Polym 目的基因 ase, 5u/ul1 ml AMV/Tfl 5×Reaction Buff 目的基因1.25 ml MgSO4, 25 mM100ul dNTP Mixture, 10 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP50ul Positive Control RNA with Carri 目的基因 (1.25 attomole/ul ...

基因表达之RT-PCR之我见在论坛上看到不停地有人在问RT-PCR的问题，实际上在以前的帖子中各位香主和eeflying（我为什么总是提他们？因为还是很佩服的哦，生怕自己说错了，被他们指出来哦）都谈到了很多，鄙人也充大头答了一些问题，但是还是有各种问题，由于的基因表达还有点实战经验（但也技止此而），所以想些点东西给大家参考，计划把包括RNA酶保护分析，northernblot，原位杂交，半定量RT-PCR和定量RT- ...

做了点甲基化研究，从头下来，也有一点点体会。也看了院子里不少牛人的新的体会。本人将每一个步骤的具体操作、每个操作的具体注意事项和心得进行初步总结，慢慢叙来，抛砖引玉，欢迎拍砖。做到现在，有成功的喜悦，也有失败痛苦，且行且歌，总得来说，BSP/MSP，想说爱你不容易。如有时间，想谈谈：BSP/MSP引物设计；基因组海量甲基化数据分析；MSP设计及操作；当前MSP的研究进展，等等吧……1.确定目的基因后，登陆一下网址：http:// ...

在丁香园友的奉献和版主的努力下，丁香园引物库和大家见面了。所有引物均为丁香园友提供，欢迎广大战友引用或使用，使用前请自行验证。如使用中有任何问题，请及时反馈我们，以便修订和完善。使用意见反馈请在本贴跟贴，或PM与版主联系。注：不得用于任何商业目的引物库将根据园友提供的引物而不断更新。您付出一点，我们的引物库会更加多姿。提交引物请点击这里人(homo sapiens)内参beta-actin(人或鼠) β-actinβ-act ...

PCR技术讨论版的公共邮箱为：dxypcr@163.com ，备份邮箱：dxypcr@126.com希望战友在上传的时候，同时上传到两个邮箱，谢谢！（大小1G,最大附件30Ｍ）。点击此处去邮箱为了帮助新手尽快熟悉实验，为了方便大家上传及下载资料，我们借鉴蛋白版的宝贵经验，准备设立公共邮箱，欢迎大家踊跃利用邮箱上传及下载资料，战友在上传资料时，先确认公共邮箱中有没有，如果已有上传，原则上不予加分。有需要者ＰＭ与我联系索取密码 ...

real-time PCR:http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=107005&sty=1&tpg=61&age=0http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=225218&sty=1&tpg=57&age=0http://www.dxy.cn/bbs/thread/190819http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=641204 ...

1.引物设计的原则http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=2316237&sty=3&keywords=%D2%FD%CE%EF%C9%E8%BC%C6http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=2316237&sty=3&keywords=%D2%FD%CE%EF%C9%E8%BC%C6（基因芯片引物设计）http://www.dxy.cn/bbs/post/view?b ...

个人感觉做RT-PCR重要性排序:排第一的是引物,第二的是退火温度,第三才是模板.(1)引物引物可以自己设计或者参考自名牌期刊如5分以上的或本专业排名前四的期刊.因为这发表在这些期刊上文章的作者没有必要在方法学上造假,所以他们提供的引物序列是可信的.建议大家针对同一基因设计或者查找2对不同引物序列,合成一对引物时最好找2家不同的生物公司合成此物,如英俊(invitrogen),上海生工等.具体原因是,引物合成不可 ...

最近楼主才回来，由于很长时间不做这方面的工作了，很多新概念和新方法可能跟不上大家了，说的不对请见谅啊。感谢大家的踊跃发言。最近看到很多战友在做miRNA的荧光定量PCR检测试验。也没看见有专门的讨论帖，拿自己以前做的试验晒晒。开个帖子欢迎大家来提问题、讨论。 另外希望各位战友有用没用千万看贴回个贴阿，以免此帖沦丧无尽之海。:D:D:D:D 目录如下：一、MiRNA简介二、反转录引物分类以及设计原理三、引物探针设计四、试验操作 ...

定 量 PCR 技 术 简 介http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=352699&sty=1&tpg=43&age=0定量PCR技术http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=394471&sty=1&tpg=37&age=0竞争定量PCR（competitive quantitative PCR）http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=766244 ...

基本知识http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=19789&sty=1&tpg=70&age=0http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=89547&sty=1&tpg=66&age=0http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=701942&sty=1&tpg=13&age=0关于如何计算引物和核酸浓度的方法http://www ...

primer premier 这款大名鼎鼎的引物设计软件就不多介绍了。直接进入主题一、创建具有管理员权限的Command命令行快捷方式（因为windows 7 cmd默认不是以管理员权限运行，所以一定要改成以管理员权限运行才有用）。1、在桌面空白地方，点击鼠标右键，选择“新建”→“快捷方式”，如图：2、弹出创建快捷方式窗口，输入cmd.exe的路径及文件名，如图输入cmd.exe可执行文件的地址C:\Windows\System32\c ...

最近因为发现一个gene在多种肿瘤中被silenced, 我也在做DNA甲基化. 这里把我折腾1个月的经验和大家分享:)1. Genomic DNA extraction这一步其实也很重要,尤其是对tissue来说. 大家知道DNA hypermethylation会导致chromatin结构紧密, 所以这一步尽量去除DNA结合的蛋白很重要. 我们实验室常用Qiagen的两个kits效果都不是太好,最后还是用proteinase K处理后酚提醇沉 ...

一直以来，不少战友在本版块反复发帖索取Primer/Oligo等软件及其注册码，甚至一再跟帖电邮索取，大大增加了版务工作！更重要的是违反了论坛相关规定！在丁香园虚拟社区基本规则中明确规定：在技术类讨论区讨论盗版软件、注册码、软件**等属于违例行为！另请阅读：关于通过Email在论坛索取资料的管理自公告之日，望各位战友自觉遵守版规，尽量避免此类事件反复发生！一经出现，初次给予锁帖并警告，警告不听者将从严处理！友情建议 ...

正在着手做real-time PCR的朋友们，我想最开始肯定要考虑引物设计的问题。看完下面的文字，我保证你得到想要的引物设计方法和引物序列。第一步：拿到你所要研究的基因的序列。不要告诉我你不会找序列。如果真的不会，请参考丁香园内其他版块，如NCBI使用，序列查找等。第二步：确定你想用哪种方法。Taqman Probe还是SYBR染料？两种方法各有利弊，这里不赘述，不明白的依然参见其他版块。但需要指出的是，后者在国内更常用，因 ...

现在仍然以逆转录RT-PCR为主要技术手段之一来做课题的可能不很多了，但恐怕很多人在过去的研究项目中使用过或者正在使用RT-PCR。很多人都是用用beta-actin或者GAPDH作为内参的，并且也有不少文章发表过了。最近偶然发现2001年就有文章《Beta-actin--an unsuitable internal control for RT-PCR》发表反对千篇一律用beta-actin做内参照，原因可能还不止一点。下面是该文 ...