PCR技术

PCR在临床检验中的应用医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技 ...

PCR-SSCP(PCR-single strand conformation polymorphism) PCR 是 DNA 的聚合酶链式反应 ,SSCP 是单链构象多态性。 SSCP 一般都要采用 PCR 扩增的方法进行检测 , 故名 PCR-SSCP 。此项技术的原理是 , 不同序列组成的单链 DNA 或 RNA 在非变性聚丙烯散胶凝胶中电泳 , 会因其空间构象不同表现出不同的迁移率。因此 , 可以将基因组中特定的 DNA 片段用 PCR 方法扩增 , 然后变性成为单链 , 在非变性聚丙烯酷胶凝胶中进行电泳 , 与对照的 DNA 片段进行比较 , 只要它们之 ...

RFLP－－限制片段长度多态性限制性片段长度多态性（RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism）　　RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。它是第一代DNA分子标记技术。Donis―Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment Length Polym ...

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一、RT-PCR 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 二、RT-PCR具体步骤 详细参考：RT-PCR ...

实时荧光定量PCR 从1996年美国AppliedBiosystems公司推出实时荧光定量PCR技术以来，该技术已经越来越广泛的应用到各类RNA的研究中，成为研究RNA必不可少的实验手段之一。目前比较常用的方法有两种： （1）TaqMan荧光探针法：该方法在特异性探针的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，荧光基团发光被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，探针被降解，荧光 ...

Cell Signaling Technology(CST)7月29日宣布，将关于使用PCR（即聚合酶链式反应）检测ALK基因重排的专利权的全球非独占性许可授予Cepheid公司。Cepheid公司将开发一种诊断试剂，用于鉴定ALK基因重排型非小细胞肺癌(NSCLC)患者。 肺癌是全世界癌症死亡的首因，每年有超过180万个新病例被确诊，其中大约85%是非小细胞肺癌。由于此类患者通常 ...

一、PCR技术及步骤 聚合酶链式反应（PCR） ...

做了点甲基化研究，从头下来，也有一点点体会。也看了院子里不少牛人的新的体会。本人将每一个步骤的具体操作、每个操作的具体注意事项和心得进行初步总结，慢慢叙来，抛砖引玉，欢迎拍砖。 做到现在，有成功的喜悦，也有失败痛苦，且行且歌，总得来说，BSP/MSP，想说爱你不容易。 如有时间，想谈谈：BSP/MSP引物设计；基因组海量甲基化数据分析；MSP设计及操作；当前MSP的研 ...

北京协和医学院 阜外心血管病医院 心外科 心血管病国家重点实验室吴益和 实验中必须坚持的一些好习惯 1.加入试剂之前把它混匀一下以免放置时间长了浓度不均 2.移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性 3.所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因一、防止RNA酶污染的措施 一、防止RNA酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前 ...

本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI， ...

1.问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。可能原因： 1）RNA被降解 (如何确定RNA是否被讲解，详见前“植物RNA的提取”。)建议解决方法： 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA； 在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA； 如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或 ...

PCR:We generally use 1-2 ul of starting paraffin microdissected DNA for each 50 ul DOP-PCR reaction.We assume that about 1 ug of product is produced in each DOP-PCR reaction. The entire product is the ...

克隆PCR产物1)克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液 50ng质粒DNA1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4oC过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4oC过 ...

PCR反应体系与反应条件　标准的PCR反应体系：　　　　　　 10×扩增缓冲液 　 10ul　　　　　　 4种dNTP混合物 　 各200umol/L　　　　　　 引物 　　　　 　 各10～100pmol　　　　　　　 模板DNA 　　　 　0.1～2ug　　 　　　　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　　　　　　　 Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　　　　　　 加双或三蒸水至 　10 ...

各位先生，各位女士，各位来宾，各位领导，各位海外侨胞，港澳同胞，欢迎参加两位新人的结婚晚会哦 啊 拿错了， 这是我明天参加婚礼的发言这个才是各位战友 我们来聊聊PCR ：）PCR可以说是目前分子生物学实验中应用最为广泛的一种技术。从最初的在几个水浴锅里把试管放来放去，到现在各种先进的PCR仪， 到REAL TIME PCR。 设备是越来越先进，方法是越来越多，但基本的原理还是那套。然而实际操作中， ...

PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失 ...

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污 染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生.一、污染原因　　(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染 ...

聚合酶链反应（PCR）技术的发展和应用 第一节　概述　　聚合酶链反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction PCR），又称无细胞克隆技术(“free bacteria”cloning technique)，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增1 ...

第八章 聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第一节 概 述　　PCR(Polymerase Chain Reaction聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Exte ...