PCR技术

zhanghai123 大家好！我最近在做测定一种GPCR是否会引起细胞内钙离子浓度波动的实验。我是用共聚焦去测定，通过C3染料来检测。请问，在GPCR被配体激动后，假如我的GPCR是偶联Gaq的，一般多长时间就可以引起细胞内钙离子波动？我是直接在共聚焦上先用含钙PBS去测基线，之后洗掉PBS，直接加含药的PBS，然后开始测，5秒钟测一次。不知道这样时候正确。谢谢高手指教！kern6549 共聚焦检测很难实现定量，不适合 ...

MENGSG 请教各位战友单核苷酸多态性（SNP）的含义。如CTLA +49(A/G)，是指一个基因位点碱基A换成了G；那么CTLA +49基因型 AA,是什么意思，是一个基因位点还是两个，还是指A没有换成G，仍然是A？其他如AG，GG是什么意思？很困惑！song333 SNP: "S" means single, one nucleotide, not two.AA: both allele is AAG: one allele is A, another allele is GGG: both allele is GMENGSG ...

haina_w 想把卡那基因从pET8b上克隆下来用作其他基因的筛选标记，但是有点儿不明白怎么克隆，引物该从哪个地方开始设计~是从pET8b的图谱上指示的那个kan基因的起始开始吗，那启动子是包含在里面的吗？？doctoryubing 如果新载体上有启动子，应该不需要包含启动子，只需要在kan基因的两端设计引物即可j19s87x 楼上说的没错，但是新载体上要是能启动卡那的启动子！本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有 ...

gaoxiaomeng :^)woxingwosu 基因是不是可以简单理解为从ATG到终止密码子为止？如果是这样，那就没有多少选择，直接就是Forward: ATGNNNNNNReverse: STOP CODON NNNNN (注意要互补的~~)zjubell woxingwosu wrote:基因是不是可以简单理解为从ATG到终止密码子为止？如果是这样，那就没有多少选择，直接就是Forward: ATGNNNNNNReverse: STOP CODON NNN ...

candyjiang 1.知道某启动子序列用什么方法将其克隆出来？2.将启动子碱基数太多，如何将其中某一段已知序列克隆？cedar1985 设计引物,PCRcandyjiang 序列太长了，有5000多个碱基，那我是要把我启动子的其中一段用PCR扩增出来？？模板从cDNA文库中调取？？我们自己实验室没有cDNA文库，找哪个公司做比较好（广州）thltyz 启动子没有在cDNA文库中，在genomic DNA中，用DNA为模板才能扩出来 ...

泌外医师小李 在培养液中加入a蛋白质可以提高骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的分化率，但a蛋白质使用周期长且价格昂贵，请用基因工程解决这个问题。小弟无才，在此请教各位高手，望不吝赐教，谢谢！woxingwosu 估计是要自己克隆表达蛋白吧。zhujoker 你如果是应试，在这儿找不到什么好的答案的。这个问题你还不要说，即使是做原核表达，还不定能够做到你想要的那种纯度以及质量，建议你如果不是专业性的实验员，你还是在其他方面省省， ...

sfflpf 我想问一下大鼠与豚鼠的基因序列是否同源，研究某种物质的基因表达，对于这两种动物，可否共用一对引物？谢谢吴佰霖 具体基因具体分析,大鼠与豚鼠就像人与大猩猩一样zjubell sfflpf wrote:我想问一下大鼠与豚鼠的基因序列是否同源，研究某种物质的基因表达，对于这两种动物，可否共用一对引物？谢谢既有同源区，也会有不同源区。总体来说，很接近了。一般来说，维持功能的部分应该是比较保守的。因为不清楚你到底指哪个基因。 ...

buloubulou 本人前期试验发现内含子上某一SNP点与干扰素治疗疗效相关，想进一步做相关功能。虽然内含子上的SNP点不导致mRNA、蛋白水平的变化，但内含子并不是完全一点功能没有，比如调控作用什么的。该内含子SNP点的功能研究方向是什么?不知从哪下手， 请教各位大虾啦，急！！:~):~)freecell Refer to this paper:http://jcem.endojournals.org/cgi/content/full/90/5 ...

lyvo 请问各位大侠，知道一个SNP的rs号 如何知道其在该基因中的具体位置 （如何知道其处于基因中的第几个碱基）？lyvo 例如rs2297518 对应的 -954G/C 是怎么查到的？madamcurie 回复楼主：关于SNP的rs问题，你可以看一下园内的一个贴：（可以很好的让你学会相关的知识）http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=9611445&sty=1&ticket=ST-85768-Eey5zIB ...

华农病毒 朋友们：最近在研究HSP，想设计一些人源的HSP荧光定量引物，不知道从何下手！自己设计的引物各中条件还不确定，想找一些报道的，但是没有找到……希望高手指点交流下！非常感谢！ylhuang0502 LZ的查找方法可能不对，你可以用如下关键词"heat shock protein and real time pcr and human" 在google/scholar查（你可以选2005年以来的较新文献），下面的一篇文献是有关Hsp27， RT-qPCR的 ...

sissiwubing 请问哪位高手知道LA-PCR是什么？zjubell Long and accurate polymerase chain reactiontakara的目录做的比较好，有这些介绍的。不妨去看一下。另外，请不要随意用‘哪位高手知道’这种话我是菜鸟，但是会用GOOGLE，就完全可以回答这种问题了。sissiwubing 看来你是自认为高手才进来的了，菜鸟zjubell sissiwubing wrote:看来你是自认为高手才进来 ...

mnidr 我现在要做一个有9个基因的基因家族的northern杂交，看一下这些基因的表达情况。需要设计cDNA的引物去P出一段500bp左右的片段来进行探针标记，但是这9个基因的同源性太高了，只能在cDNA序列的两端找到一些非保守的区域，但是实验室的一个师兄说，cDNA两端是不能设计引物的，因为RNA的两端是“可变区”在这些可变区设计引物，做PCR可能会出不来结果，就是说网上查到的RNA序列两端的几十个碱基是 ...

dxyqxl 麻烦问大家一下，构建载体时，何谓正向插入与反向插入啊，两者有何区别，跑胶以后的片段长度应该是一样的吧？谢谢各位啊！slytjiaofei 载体总的大小一样，但经过酶切后产生的片段长度有区别，不然怎么鉴定是正向还是反向，有的载体只有方向正确了才能进行下一步的转染表达，建议还是多看点相关的文章！阿呆硕士 一般的克隆型载体，其方向性就不是特别重要了，它关键的是目的片段的一个载体，最典型的没有方向性的就是T-A连接了。 ...

yinfengzhizi 我需要做QRT-PCR，想用U6做内参，研究的标本时牛，可是我在NCBI的nucleartide上一搜，发现一下子出现好多，长度和序列也不同，不知道该选用哪一个。是查的方法不对么？还是需要再做些什么工作？望高手指点！zhujoker 你需要选择一下物种，要不的话你就看不清到底是什么了yinfengzhizi 我查的是牛的，用了cattle U6 snRNA,出来9个结果，长度不同，且用软件分析同源性，只有一 ...

cypress1975 克隆100个已知序列的基因于带有绿色荧光蛋白的载体中需要多少时间和经费？非常感谢gingivalis 方法：在NCBI中搜索下面的关键词，能在《methods in molecular biology》系列丛书中找到很多文章。high throughput cloning methods in molecular biology时间估计不会太长。关键花时间的是克隆以后的工作，表达，活性分析。钱，不知道，多多益善。版主freece ...

flowriver 新生，第一次来发帖，请教：PCR做出加药后上调的趋势，但是Western却是下调。应该怎么解释呢？如果能附上相关文献的检索就更好了。谢谢！！！freecell 在回答这个问题前，请楼主回答几个问题：1、你的“PCR和Western的结果不相符”这个结论，是重复几次试验后，观察到的结果？2、你的PCR样品和WB样品来自体外还是来自体内？3、你的PCR是常规PCR，还是定量PCR，还是定量RT-PCR？4、你的PC ...

kiki_1998 请教如何查找KRAS 12 13 突变位点的两端序列？在NCBI的SNP中好象没找到外显子2的12，13密码子的SNP两端序列。不知应该如何查找它NCBI的序列号？zhujoker NCBI Reference Sequence: NM_004985.3http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004985.3以及http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrezkiki ...

vangolf 小弟一直在做NFkappaB与IkappaB，有几个问题一直搞不明白，查了一些文献也没查到什么内容1 IkappaB磷酸化及泛素化之后，也就是降解了，NFkappaB就可以入核，也就是说IkappaB的量下降了，我用RT-PCR法可以检测到IkappaB相关的表达吗？可果用RT-PCR方法得出IkappaB的表达随时间增强，是不是意味着有更多的IkappB与NFkappaB结合？我用RT-PCR方法检 ...

mnidr 没做过，看了一些东西有点糊涂了，微卫星两端的序列是高度保守的才能根据它设计引物来P出不同大小的微卫星片段那么这个微卫星两端的序列是侧翼序列吗(UTR)？？？如果是的话，侧翼序列不是高度可变的吗，怎么又成了高度保守的呢？mnidr 自己顶下ffyy8888 晕死，SSR的高变异，多态性指的是核心重复序列的变异度高，其侧翼序列是保守的，这个是基本概念呀lmnsmu SSR两端的侧翼序列，是基因组DNA，往往是保守的；mn ...

maiqitu 在构建载体的时候要往里面加rabbit beta-globin intron，请问是为什么呢？谢了啊zhujoker 那你到底是构建什么载体啊？还需要往里面加rabbit beta-globin intron，我也觉得奇怪。但是有一个东西是可能的，那就是你构建的是miRNA表达质粒，因为miRNA位于大多数基因间，也就是位于内含子得地方？不知道是不是你所想要的，呵呵！hcai55 恩，miroRNA表达载体有些是这样。比如 ...