PCR技术

进行一次成功的连接实验需要优化一系列实验指标。A）载体和插入片段的摩尔浓度比特别重要，载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。插入片段的长度和序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要作实验，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。B）进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言，平 ...

甲基化特异PCR（Methylation-specificPCR）资料大全关键词：甲基化特异PCR、DNA甲基化、Methylation-specificPCR、甲基化特异PCR文献、甲基化特异PCR引物设计、甲基化特异PCR实验注意事项第一部分：甲基化特异PCR文献5 undefined A! Y" w1 g8 \$ W9 E8 {/ undefined V; t! Z: undefined Q6 ^+ Q4 c( l7 U( F' g, b8 o. K- j: w% a. ?: o7 第二部分：实验protocol第三部分：甲基化引物设计http://www.urogene.org/methpr ...

PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10k ...

初来乍到，我刚查到的一篇文章。希望对大家有点帮助！怎样选出最合适的Taq酶随着分子生物学研究发展的不断广泛和深入，PCR已成为一门相当成熟的常规技术，而热聚合酶（即Taq酶）的合理选择是PCR成败与否的一个关键因素。目前市面上有多种Taq酶，能够满足多方面的实验需要。那么，如何选择最合适的Taq酶？根据用户经常考虑的指标，如特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等，我 ...

由那位老师作过醛固酮合酶的RT-PCR，我已经P了两个月了，还是为扩出来。我用Wistar 大鼠的心肌及肾上腺组织提取RNA并RT，后进行PCR，已经换了3个引物，其中由两对引物是文献（英文一篇）报道的，但还未P出来，PCR条件我都试了好多次了，同样的标本P其他的3对基因都很顺利，就这对出不来，郁闷死了！！如果出不来结果以前的试验就白做了。下面是我的一对引物及基因序列：请帮忙分析一下，尤其是作过醛固酮合酶CYP11b PC ...

贴出我的问题来晒晒，也很郁闷的一件事。相同方法提Ｃａｓｅ　＆　Ｃｏｎｔｒｏｌ两组ＤＮＡ，同时扩增片断A(易扩增)，问题Case组结果良好，而Control组没有结果；于是分别混出一支ｍｉｘ。Ｎａｎｏｄｒｏｐ测浓度：见二者结果相仿，就又把A扩了一遍。下图中2-7道为模扳上样梯度。鉴于Nanodrop的比值没有太大偏差，考虑control溶液中的其他未知杂质，采取酚-氯仿-异戊醇重新抽提、乙醇沉淀洗盐纯化，原体积1/2的ddH2 ...

大家好，Fluidigm BioMark 系统通过集成流体通路（Integrated Fluidic Circuit, IFC），将上万个微小管道、控制阀门集成到微板上，形成纳升（nL）量级的反应仓，不需特别移液器，就可以同时进行多达近万个常规qPCR (传统Taqman 或其他) 实验。操作简单，既有传统qPCR可定量之好处，又有基因芯片高通量耗材少之优点，能大幅提高实验效率及准确度。· 单个细胞基因表达( Single Cell Gene Expression): ...

关于PCR假阴性问题总结（建议大家看看）PCR的假阳性问题深受重视，但我个人认为PCR假阴性问题相对于临床检测更为严重。其实PCR假阳性的问题是比较单纯的，一般仅涉及污染和引物的非特异性问题。而污染可以通过严格的实验室管理，合理的环境设置，以及加入UNG酶抗污染基本可以解决，而引物的非特异性问题基本属于厂家试剂质量问题。而PCR的假阴性却不同，它涉及了与PCR实验的几乎所有人员和技术环节，十分复杂。就临床而言， ...

　　附件炎应怎样治疗?患上附件炎有什么危害?附件炎是指输卵管和卵巢的炎症，长期久坐、常穿紧身裤、不注意经期卫生都容易引发病菌感染而导致附件炎。下面专家对附件炎的危害及治疗方法进行了介绍，一起来了解下吧。　　得了附件炎怎么治疗?对于很多女性来说，附件炎是一种常见的妇科疾病，发病率也在不断增高，同时对人的身体有一定的伤害，需要引起女性朋友的重视。那么，得了附件炎怎么治疗?针对这个大多数人都很关心的问题，下面请北京艾丽斯妇科医院 ...

我想请教大家：我的PCR跑出四条带，亮度不相上下，包括目的基因，其余杂带比目的带短，退火温度52-58都试过，没改善。接着调高退火温度有可能得到特异条带吗？会不会引物设计有问题？我用的是PRIMER DESIGNER 1.01.烦劳看看我的基因序列，引物，要真有问题，就死心塌地重订引物了。1 cggcagcagc gggaggcgag gggcgccacc gaggagccga gcccgccgag ccgggcgctc61 tatttcagcg gg ...

师兄有云： 话说，那张无忌在山谷里练了五年九阳神功，相当于读了一 PHD，后来又在明教暗道里搞了个post-doc，出道立马名动江湖，打的第一份工就是接管了一个破落实验室。接手实验室的第一天，无忌就发现手下小昭是个既有心机，又有城府的小姑娘，长得好看且不说，还有一身功夫，还精通八卦五行之术。但就是荧光定量 PCR 老是做不好。咋办捏？一天，无忌君找到小昭无忌曰：“小昭，你觉得现在做实验有什么困难么？”小昭曰：“无忌哥，我好多问题，就是不知 ...

多少同学能将 RT-PCR、Realtime-PCR、QPCR区分清楚？有多少同学还在犯晕？今儿这贴，师兄就带你区分区分，人家破除迷信，咱就来个破除 PCR 迷雾。什么是 RT-PCR？逆转录PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通 ...

qPCR的数据相对定量分析其实很简单。我做了很多的qPCR实验，也看了很多的资料，包括Nature protocol， AB官方的分析教程，MIQE，甚至包括一些商业化软件使用的教程及教程里面记述的原理。我在这里跟大家分享一下自己的经验，最常用，最普遍的相对定量方法就是2^-△△Ct法，该法最最简单的说就是：首先将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值，得到的数就是△Ct ...

终于把一批小鼠样品的荧光定量实验做完了，可以松口气了。期间吃过亏，也学到了很多经验。今天刚好有时间，就把这些经验写下了，跟大家分享交流，希望对跟我有相同经历的人有所帮助。先说说我吃的亏吧： 提取小鼠心脏RNA，做逆转录，然后用逆转录的CDNA做Real-time PCR。最后发现，Real-time PCR结果CT值都很大，连内参的CT值也超过了32。 当时看到这个结果就懵了。别人的Real-time PCR结果我见过，CT值一般在30 ...

Methods in Molecular Biology vol.687 Park D.J. (ed.) PCR Protocols Chapter 5PART II ：Cloning and SequencingCODEHOP PCR and CODEHOP PCR Primer DesignJeannette P. Staheli, Richard Boyce, Dina Kovarik,and Timothy M. RoseAbstractWhile PCR primer design for the amplification of known seq ...

Methods in Molecular Biology vol.687 Park D.J. (ed.) PCR Protocols Chapter 4PART II ：Cloning and SequencingLariat-Dependent Nested PCR for Flanking Sequence DeterminationDaniel J. ParkAbstractMethods detailed in this chapter relate to the use of Lariat-dependent Nested (LaN ...

Methods in Molecular Biology vol.687 Park D.J. (ed.) PCR Protocols Chapter 3PART II ：Cloning and SequencingIsolation of Genomic Insertion Sites of Proviruses Using Splinkerette-PCR-Based ProceduresBin YinAbstractThe availability of whole genomic sequences provides a gr ...

去年我一直在跟qPCR、逆转录和SYBRGreen QPCR反应做斗争，其中遇到了不少困难，现在已经告别当初的迷茫。当时在我艰难摸索的时候就想，等我都学会了，我一定要写篇帖子，把当初遇到的一些困难和最后是如何解决这些问题的，写出来，一来可以帮助更多像我这样的人，二来也算让自己有点成就感了。其中有一次，RNA提取好了，跑完胶3条带非常漂亮，测了浓度有500ng/ul呢，做完逆转录，满怀信心的做QPCR反应，做完发现Ct值 ...

Setup of a PCR LaboratoryAbstractPCR represents an extremely powerful and central molecular biology method. At the heart of its poweris the exquisite sensitivity offered: single molecule detection in certain contexts. However, with greatpower comes great responsibility. Con ...

1. 如果扩增曲线ct值比较靠后的话，32左右，一般有什么方法解决没有ct值比较靠后，对实验有一定的影响，因为经过那么多次的循环，酶的活性有可能有所下降，这时候扩增效率会有所改变（而定量PCR的理论基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值）。因此最好能够把ct值往前移。解决办法可以将模板加以浓缩或者抽干之后用少量水去溶解。2. 为什么合成的引物做不加摸板的对照也能扩增出目的条带，而内参用同样体系就没有呢?引物被 ...