PCR技术

我用primer premier设计的引物,但是好像有错配.1ctctccaaga agactcagcc agacccactc cagctccgac cctaggagac cgacctcctc61 cagacggcag cagccccagc ccagtggaca accccaggag ccaccacctg gagcgtccgg121 acaccaacct ccgccccgag accgagtcca ggctccggcc gcgcccctcg tcgcctctgc181 ac ...

真郁闷啊，一个目的基因扩增了3个月也没出来，换了好几个引物，都是文献上的，结果不是产物bp数不对，就是目的条带超暗还有非特。一咬牙，决定赶鸭子上架自己设计一把，结果用primer premier 5.0设计出来的引物，一个90分以上的都没有，也没有错配、发夹等全“NONE”的结果出现，拿分值最高的去OLIGO验证，实在很不理想。当然我知道不可全信软件，但是总得找个让自己信服的根据吧。唉，老板天天对我叹气，说你什么时候能给我个 ...

我是新手，对设计引物还不太熟悉，下游CG含量高，没办法下手，麻烦大家帮我看一下部分DNA序列如下：1 actgaacttc acagggcaag gggagcccga ctccattcgc tgtgacacac gagcggagct61 gctgtcaaag ggctgcccag ctgatgacat catggaaccc aagagcctcg ctgagacccg121 ggacagccag gcgggcagtc ggaagcagct gtccccacag gaag ...

PCR常见问题总汇　PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。 ...

以下是primer3自动得到的引物，请高手指导，在线等。大写字母为外显子，小写的为内含子。谢谢！！！！OLIGO start len tm gc% any 3' seqLEFT PRIMER 501 20 61.99 55.00 6.00 2.00 AGCCTGGCCAACGTGTCTATRIGHT PRIMER 1026 22 59.42 36.36 2.00 0.00 tcgttgctgtttttctgttttcSEQUENCE SIZE: 1250INCLUDED REGION SIZE: 1250PRODUCT SIZE: 52 ...

影响PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。　　一、温度循环参数　　在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退 ...

问题可能原因建议解决方法定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量DNA模板质量不好，含有抑制剂提高模板质量，诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNAPCR引物设计较差避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。探针设计较差对探针序列进行blast比对，设计符合要求的探针PCR引物合成较差用普通电泳法，看引物的设 ...

RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b ...

差异基因表达的研究受到了广泛的关注，常用的技术有DD-PCR；GENE-FISHING；GENECHIP等。简单介绍如下：DDRT—PCR技术即mRNA差异显示聚合酶链式反应技术，此技术是以PCR技术和聚丙烯凝胶电泳技术为基础，结合银染或放射性自显影等显色技术，能快速有效地鉴定并克隆两个或多个平行材料之间的差异表达基因。DDRT—PCR技术的基本过程如下：①提取两组平行材料中的总RNA或mRNA；②在逆转录酶作用下 ...

我做的是人巨细胞病毒gB基因，序列如下ccgcggccgtctcgggtgtcttcagggagccgcaccgaccttggctgccaagtccgtatccctcctcctcgactgcgggtgtttcccggagggtccgcgcgacacgcaagagaccacgacgcgcctcatcgctgctggatttggcccgcgacgaacatggaatccaggatctggtgcctgg ...

我做大鼠肝组织TNFalpha受体的表达，用退火温度52，40个循环都做不出，为什么？它的表达量应该很丰富的呀，会不会RNA降解了，但内参跑出来了（240bp），是不是我从文献上查的引物有问题，请高手帮验证一下；TNFR1 NM_0130911 ttttctccga gttttctgaa ctctggctca tgatcgggct tactggatac gagaatcctg61 gaggaccgta ccctgatttc catctacctc tgac ...

刚刚看到的文章，喜欢的话多多支持啊，请斑竹加分啊。LEAF PCR PROTOCOL(Klimyuk et al., 1993, TPJ 3: 493-494)1) Samples are harvested in 1.5 ml tubes and stored on ice.2) 40ul of 0.25N NaOH was added and the samples boiled for 30 sec.3) 40ul of 0.25N HCl then 20ul Tris mix was added and the samples boiled for another 2 min.-tissue samples can ...

扩增长目的片段当扩增大于5kb的目的片段时，可以使用用于超长PCR的酶或酶混合物以获得最佳产量（图24）。Taq DNA聚合酶并不能有效扩增较长目的片段（大于5kb），可能是因为其缺少3'-5'外切核酸酶活性，不能纠正dNTP错误掺入。错误配对的延伸几率大大降低，减少了较长产物的产量。将Taq DNA聚合酶同带有3'-5'外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶混合，可以扩增最高为30kb的目的片段。Platunum Pfx DNA聚合酶 ...

我在ncbi的gene中找我要的基因cDNA，没有找到大鼠的基因，请问我可否用小鼠的基因或人类的基因来代替，如果代替的话，会出现什么问题？我把该基因的CDs序列放上来，能否帮我看看引物设计成什么比较好。atggaac tgaaaatctg acgacatctc tcattaataa601 cacgtgtcat gacacaattg atgaattccg aaatcaagta tactccacta tgtattctgt661 gatctctgtt ...

ttattttcag tgatagtttc里是从网上钓出的一个基因的全长，我的两对能否用？第一对Forward:ATG TAT TTT CAG AGT GGC ACT GInverse:CTA TCA CTG GCG GAC CCC TAA第二对：上游TATGGCCACAAAACTTCAAT下游 ctatcactggcggaccc请问这两对引物可以用吗？谢谢！

第一部分是PCRAbbreviations ixPreface xiChapter 1 An Introduction to PCR 11.1 Introduction: PCR, a ‘DNA photocopier’ 11.2 PCR involves DNA synthesis 11.3 PCR is controlled by heating and cooling 31.4 PCR applications and gene cloning 51.5 History of PCR 6Chapter 2 Understanding PCR 92.1 How does P ...

我做半定量RT-PCR分析,不知道用哪个数据？软件是Quantity One结果：Gel name : 505 2005-04-14 11hr 31min (Raw 1-D Image)IndexNameVolumeAdj. Vol.% Adj. Vol.ConcentrationDensityINundefinedmm2INundefinedmm2INT/mm21U13315.0229129164 990.4582083559 6.1992842653N/A1284.83848788572U24154. ...

我设计了一对引物，用几个不同的软件检测，评价不一，能否有谁帮我检查一下？我的序列为：gcccgtacac accgtgtgct gggacacccc acagtcagcc gcatggctcc cctgtgcccc61 agcccctggc tccctctgtt gatcccggcc cctgctccag gcctcactgt gcaactgctg121 ctgtcactgc tgcttctgat gcctgtccat ccccagaggt tgccccggat gc ...

有关甲基化引物的帖子版内已经很多了，但是同一种基因有多种引物，各引物的反应条件又多有差别，开此帖的目的一半是为了私心，想让大家帮我看看结果，出出主意，另外也是为了增进大家的交流，减少像我这种新手在摸索过程中所走的弯路。先抛砖引玉一下，自己最近做p16.PTEN和MGMT三种基因的MSP：p16甲基化引物上游为5′- TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC -3′，下游为5′- GACCCCGAACCGCGACCGT ...

我刚接触引物设计，希望大家热心帮忙。我从ncbi中找到一些微卫星序列，用pp5.0设计引物，好像根据引物设计原则，都找不到好的引物。不知道是不是在参数的设计上有什么规定，还是有什么窍门。请高手指教。提供几段序列，请高手作为例子帮忙讲解一下如何设计引物扩增重复序列。1 ggtggtggtg ctgtgagtta tacaagaccc agtaggaagc agcggcaggc agtattattt61 cagtggtttg agccaaaact ...