PCR技术

实时定量PCR也被称为实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)，是一种在DNA扩增反应中加入荧光基团，以荧光信号积累实时监测每次PCR循环后产物总量，进而对待测样品中的目的序列进行定量分析的方法。基本原理在学习实时定量PCR数据处理之前，我们首先需要了解一下它的数学原理，Ct值为什么是我们数据处理过程中的一个关键的因素。这两个图显示的是实时定量PCR的一组结果。上图是原始的线 ...

qPCR 曲线异常问题通常分为两大类：扩增曲线异常、融解曲线异常。扩增曲线异常这个问题可能涉及到多种原因，主要可以归结为以下 6 种：（1）扩增曲线不光滑主要有两个原因，一是扩增信号太弱，经系统矫正后，就产生这样抖啊抖的线，小 V 建议大家提高模板浓度重复实验。二是仪器本身的问题，可能在扩增过程中仪器出现了波动或者本身该检测孔出现了异常。（2）扩增曲线断裂或下滑比较典型的曲线下滑如上图所示，主要原因是模板浓度太高了，在基线期内就起峰了 ...

PCR 是一个坑，坑里埋了好多研究僧……PCR 是众位「研究僧」日常实验中最常用的技术，可谓是「研究盛宴」中的一道「小菜」。可也有不少童鞋反映，这道菜不好吃，一不小心就「小河里翻船」。那么，我们该如何把这道菜「吃好」、跳出这个「坑」呢？诸位看官莫急，待我送君「三大法宝」。一、确保 RNA 样本合格常见的 RNA 提取方法有 TRIzol 法、吸附法，这两个方法各有所长，但都不能保证提取的 RNA 样本一定合格。因而，提取完成后应测定 RNA 的浓度及吸光度。通常，在 260，280， ...

茫茫的实验过程中，你是否遇到过如下的困境：做完 PCR，跑胶发现有多条很诡异的条带……更为可怕的是，做完二代测序发现了一个崭新的突变点，一代测序验证也能开心的验证出来，但发文章时，别人告诉我们，这其实是相似序列引发的假阳性……也就是说，相似序列之间的差异碱基，刚好就是那个所谓的突变点！一代测序也枉然！以上的问题，可能多半都是因为引物不特异。也就是说，同一对引物，能匹配基因组上好几个位置。所以，设计完引物，做一个在线的 PCR，以 ...

引物设计是 qPCR 非常重要的环节。今天小编给大家推荐 2 款简单实用的在线 qPCR 引物设计网站，让你分分钟搞定 qPCR 引物！Primer3 Plus推荐指数：五颗星理由：严格的 qPCR 引物设计一般要求其中一条引物要跨外显子，最好在 3' 端设计引物，产物的长度在 300bp 以内等。本在线软件可满足 qPCR 引物设计的要求。网址链接：http://www.primer3plus.com/1、选择 Run latest Versionof Primer3Plus，就进入了设计引物的 ...

SNP，全称Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式,但实际上发生的只有两种,即转换和颠换,二者之比为2：1。SNP 在CG序列上出现最为频繁,而且多是C转换为T ,原因是CG中的胞嘧啶常被甲基化,而后自发地脱氨成为胸腺嘧啶。一般而言,SNP 是指变异频率大于1 %的 ...

相信很多人一听到引物二聚体的时候都会很愤怒，因为几乎我们每个人都受到过它的折磨。它作为 PCR 的副产物，甚至有时候是主要产物充斥着我们的整个 PCR 实验过程。你在被它折磨的不行不行的时候，你有想过它为什么总是出现在你的实验结果中吗？接下来就让我带大家走进它的世界，了解它，认识它，最后战胜它。01引物二聚体是什么鬼？引物二聚体其实就是一对引物或者引物自身的 3’ 端部分碱基互补结合，在 Taq 酶的作用下从 3’ 末端延伸所形成的小分子量的双链 DNA 片 ...

充分的准备是实验成功的关键，那么，qPCR 实验需要提前做好哪些了解呢？试剂的储存条件市面上大多数 qPCR 试剂推荐 - 20 ℃ 避光长期储存。Vazyme 的 ChamQTM 和 AceQ? 两个系列的 qPCR Master Mix，长期储存应置于 - 20 ℃ 避光，解冻后可于 4 ℃ 短暂存放；避免反复冻融。原始模板稀释倍数—是不是拿到一个 cDNA 模板就直接做 qPCR？—NO!—是不是拿到一个 cDNA 模板就直接做 qPCR？—NO!—是不是对怎么确定稀释倍数倍感无助？……尽量选择 Ct 值落在 15-28 范围的稀释倍数作 ...

分子信标的设计分子信标（Tyagi and Kramer 1996) 是另一种特异的荧光实时 PCR 探针（图 1), 这种分子信标可以在体内和体外动态地、实时地检测核酸 杂交事件（Tyagi and Kramer 1996; Kostrikis et al. 1998; Tyagietal. 1998)。图1分子信标是一段双重标记的寡核苷酸（25~40nt）形成具有一个环（探针）和一个自身互补的茎的发夹结构。荧光报告分子在 5'端，猝灭剂在 3'端。室温条件下，分子信标形成发夹结构，荧光报告物质和 ...

除了为克隆基因、预测编码蛋白而需要研究基因的构成外，当前在基因组学上的努力也包括对基因组构成的研究，以分析具有结构和调控因子插入的基因。近源物种分析成为比较基因组学的主要内容，被认为是研究进化、基因功能和人类疾病的重要方法。利用该方法分析微生物，特别是细菌的基因组，早在 1996 年就已开始识别出细菌中的保守基因和与亚种相关的毒性基因（Fredricks and Reiman 1996)。这方面的进展促生了新的、大规模的检测和识 ...

这个方法适用于检测或部分 DNA 片段克隆，不适合全长基因克隆设计策略反转录 PCR 的主要问题是基因组 DNA (gDNA) 污染的存在，这将导致产生假阳性信号，特异性降低或对特定 RNA 的过高估计。为了消除 RT-PCR 中 gDNA 的干扰，可将引 物设计为与两个外显子的接合部退火，该点为 cDNA 序列专有，因此 gDNA 将不能被扩增。cDNA 特异的引物可通过三个途径设计（如下图所示）。第四章 cDNA、gDNA选择性引物设计1. 引物横跨外显子-外显子接合部。设计的引物如果一半与 ...

嵌套 PCR （nested PCR,nPCR）是指以第一次 PCR 产物为模板直接进行第二次 PCR 扩增，以增加 PCR 的灵敏度，第二次 PCR 设计的引物在第一次所用引物对的内部，这种引物被称为「内部」或 「嵌套」引物。以第一次 PCR 产物为模板进行第二次 PCR 扩增，可明显提高敏感度而对特异性无损（Albert and Fenyo 1990)。由于嵌套 PCR 使用两套引物对，在补充反应组分如 Tag DNA 聚合酶后就可能提髙总循环数。如果不能进行完整的嵌套 PCR (使用两个内部引物），为提髙灵敏 ...

设计 PCR 引物时，下面这些因素你必须要知道。引物长度引物长度对反应特异性、解链温度、退火时间都有较大的影响，最终影响到 PCR 反应 是否成功。多数情况下，引物长度约 18~30bp, 引物太短会导致非特异扩增，太长虽然会增加特异性，但是二级结构（如发夹结构）出现的概率增大。引物的解链温度PCR 反应的特异性很大程度上依赖于引物的解链温度（Tm 值）。多数 PCR 反应最优的 解链温度应在 55~60℃，如果没有其他不稳定因素，引物的 Tm 值取决于它的长度、序列组成和浓度 ...

多元 PCR (多重PCR，Multiplex PCR，MPCR) 是指在一个 PCR 反应中使用一个模板和几对引物同时扩增多个目的片段的 PCR 反应。这项技术非常有用，他不仅可以提高 PCR 的产率还能提高 DNA 样品的利用率。另一种形式的 MPCR 是组合 PCR, 组合 PCR 是在同一 PCR 反应中使用几个不同的模板和几对引物。多元 PCR 和组合 PCR 往往被当作同义词使用。设计策略MPCR 要求所有的引物对在同一条件下扩增其各自的特异序列。大多数多元 PCR 反应 局限于扩增 5~10 个目的片段，原因之一 ...

Oligo 6作为目前最好、最为专业的引物设计软件，Oligo的功能很强大，他主要功能有：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估「引物对」质量的功能，如何使用Oligo6 请参看：「两分钟教你学会 Oligo 7」Oligo 6 联合使用 Primer 5 http://wenku.baidu.com/view/da565dd380eb6294dd886c41.htmlBLAST BLAST（Basic Local Alignment Search T ...

实验目的：对RNasin性能效果进行检测及评估。实验材料及设备模板RNA：大鼠肌肉组织RNA引物：Rat β-acting：Forward CCCATCTATGAGGGTTACGC Reverse TTTAATGTCACGCACGATTTCRNase：50mg/ml（simgen）RNasin：40U/µlcDNA第一链合成试剂盒（simgen）、2×SYBR Green PCR mix（simgen）设备：ABI 7000 荧光PCR仪、普通PCR仪 ...

PCR技术自1983Mullis发明以来，给生命科学带来了历史性的变化，现已成为分子遗传学、基因组测序和作图、法医学、系统动物学等各领域内不可缺少的工具。但是，普通的PCR最长只能扩展2-3kb左右的短片段基因，对于5kb以上的长片段基因很难有效的扩增，这使PCR受到了很大限制。故人们一直以来都在尝试利用PCR扩展出更长片段的PCR。“LongPCR”这个名词和技术最早由美国华盛顿大学医学院的Barnes WM提出 ...

86964109 请教大家，如果想检测某种miRNA的表达，而miRNA本身有5p和3P两种成熟体，那我设计引物是需要针对两种成熟体都设计么？还是任意一个都可以呢？谢谢！！行云流水19880112 现在我也有同样的困惑，不知您最后是怎么确定的？？？谢谢biohh 自己设计有点难度，很容易就把pre-miRNA检测出来了，建议你购买一些公司里设计好的引物那样比较好操作结果可信些！他们的引物是分3p和5p的。jmj_011 但是3p ...

z1206 小女子想请教一下园子里的各位战友们，除了上海生工还有哪家生物公司可以帮忙设计PCR引物啊？或者园子里哪位大侠可以帮忙呢？我一对引物，自己设计后没结果，请上海生工帮忙设计，他们也说太难，设计不出来，所以形势很严峻啊，拜托各位了！~~~~~~~zjubell 尽量自己设计引物，再不行，让师兄姐帮忙。失败的过程也是自己学习的过程。连引物都不会设计的硕士毕业生，呵呵，不说了。selleckchemcials 设计引物时首先可以查 ...

英实 illidancui 你做个温度梯度试试英实 谢谢哦本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：shixiongcoming