感受态细胞的制备及其转化

本文介绍了大肠杆菌电转化感受态细胞的制备及转化方法

质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。

利用冰冷的CaCl2 制备competent cells以传统方法进行质体的转形。 仪器用具：37℃培养箱；42℃水浴；冰浴 药品试剂： 0.1 M CaCl2置冰浴中 2 M glucose： 取18 g glucose溶于水中，并调体积至50 mL，无菌过滤，分装后置 -20℃贮存。 2 M Mg2+： 取20.3 g MgCl2 · 6H2O及24.65 g MgSO4 &mi ...

取80 mL SOB培养基装入250 mL灭过菌的三角瓶。 另取1 mL SOB加于微量离心管中。由SOB固体培养基上选8 个约2~3 mm大小的单一菌落接入1mL SOB中，震荡将菌体打散后，加入80 mL SOB中，于37℃震荡培养约2~3h,直至细胞数约为4~7×107/mL.

文章作者介绍了一种基于脂质体的高效siRNA转染方法。利用该protocol，可以在CCE细胞达到98%的转染效率，在D3细胞达到80%的转染效率，并且对干细胞的形态没有影响。

DEAE－葡聚糖介导的转染，其原理还不清楚，可能是通过内吞噬作用而使DNA转导进入细胞核，此法只适合暂时转染实验，转染效率与DEAE-葡聚糖浓度以及细胞与 DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系，可采用较高浓度的DEAE-葡聚糖（1g/L）作用较短时间（30分钟-1.5小时），又可用较低浓度（250g/L）的DEAE-葡聚糖作用较长时间（8小时）。 方法如下： （1）接种鼠L成纤维细 ...

脂质体（lipofectin regeant，LR）试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy， Propyl]-n， n，n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1：1（w/w）]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。

核酸以磷酸钙－DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%~5 %可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。 1、配液 ...

学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入……

各种转染方法比较：DEAE－葡聚糖法、磷酸钙法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物、病毒介导法、Biolistic颗粒传递法（基因枪粒子轰击法）、显微注射法、电穿孔法。

一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素 ...

国外的同学说一般他们克隆都是直接购买感受态细胞转化，实验效率很高的。我总是以为如果是一般的克隆实验，自己做感受态好像够用了－－如果是建库，购买现成的感受态细胞就是非常必要的首选，因为转化效率确实比实际手工制备的高2－3个数量级以上，特别是建库，能实实在在地提高实验的效率。实际上，除了建库以外，Stratagene为更好的表达蛋白、以及转化效率较低的巨无霸质粒，而特别优化了一些感受态细胞，做表达的人 ...

根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的 ...

快速细胞破碎法实验步骤 1、 挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中，37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8。 2、 取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。 3、 加入70μl Cracking Gel缓冲液20%SDS 10ml 250mmol/L EDTA 1.6ml蔗糖27.2g 1.2%溴酚蓝1.67ml，加双蒸水 ...

1、 存放：超级感受态细胞必须从干冰运送包装箱取出直接放入–80°C冰箱的底部。一定不要用液氮来存感受态细胞。 1) 存放条件：超级感受态细胞对微小的温度改变也极度敏感，因此必须存放在–80°C冰箱的底部。即使是将细胞从一个冰箱转移到另一个冰箱也会导致转化效率的损失。采用BD Falcon 的14ml聚丙烯圆底试管：在转化实验中使用圆底14-ml BD Fa ...

致癌化学物转化细胞： 转化叙利亚地鼠胚胎细胞实验 实验步骤： 1、 取材：妊娠后第13天取材，取数个同窝胚胎，去头和内脏，在无菌条件下剪碎至米粒大小，再用0.25％胰蛋白酶（含0.01％EDTA）37℃消化30分钟，滤过、低速离心、吸除消化液、加入营养液、制备成细胞悬液、接种入75cm/培养瓶中，接种密度10～20×106/75cm，37℃培养2～3天，在顺利情况下能迅速长满瓶面。 2 ...

1、 在冰上预冷2支14-ml BD Falcon聚丙烯圆底离心管。1支用来转化样品，1支做pUC18对照。同时将NZY+ broth培养基在42°C预热。 2、 冰上融化感受态细胞。融化时轻轻将细胞混匀并分装成100ul/管。 3、 每管中加入随试剂盒提供的4 ml b-ME（巯基乙醇）。 4、 温和转动试管，将细胞在冰上放置10分钟，每2分钟温和转动一下。 5、 每管细胞加入0.1&n ...

试验试剂： PLATE溶液： iZN ；40％聚乙二醇（PEG，分子量3350；Sigma P 3640）；0.1mol/L 醋酸锂 g；10 mmol/L Tris-HCl （pH7.5）；1 mmol/L EDTA； 实验步骤： 1、 用牙签从平板中挑取单菌落（直径2～3mm），转移到1.5ml的无菌离心管中。 2、 将10μl载体DNA（100μg）与10μl转化质粒DNA ...

实验原理： 体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含重组的阳性克隆。在此阳性克隆中，DNA可在生物体系中大量扩增，繁殖， 保存以及表达目的基因的产物，这是ＰＣＲ体外扩增DNA所不能替代的。配合DNA重组技术，所获得的，不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。 质粒转化不同细菌有不同的转化效率，转化效率的高低与实验的成败直接相关， ...

方法一： 效率非常高，一般可到1undefined8，好时可到1undefined9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。 实验试剂： A液：1M，MnCl2 B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌； C液 称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121 ...