RNA实验技术

RNA提取应该说已经成为了一种常见的分子生物学操作步骤了，但是不少科研人员仍然烦恼着如何寻找一种最好的方法，或者找到一种适合于特殊用途方法。比如说传统的血液标本表达谱芯片实验需要先把有核细胞从全血中分离出来，加白细胞分离液、离心等步骤，比较繁琐，如果能进行全血的提取，那就再好不过。

RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。RIP这种新兴的技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。

mRNA差异显示技术（differential display,DD）是用于研究基因的差异表达的新方法。在应用过程中不断得到改进，并产生了诸多衍生技术如RPA、GDD等。本文简要介绍在本试验室荧 光标记差异显示技术（fluorescent DD,FDD）的应用及体会。

本文总结概括了siRNA设计的方法。

从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。因此，从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是顺利进行上述研究的关键所在。

RNA实验中实验失败的主要是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解。因此在实验中严格控制外源性RNA酶的污染，最大限度地抑制内源性的RNA酶显得尤为重要。

本文介绍了RNA的制备与分析方法

本文介绍了RNA的提取步骤和相关注意事项

TRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCO BRL公司推出专供提取RNA的产品，其操作方便、快捷。

异硫氰酸胍法制备组织和细胞RNA：（一）试剂准备：CSB缓冲液

mRNA提取纯化

之前已分别构筑出GUS 基因的表现质体pQG11若要令启动子T5promotor 的启动受到更好的调控，应进一步将pQG11 转形至大肠杆菌M15. M15 可持续表现lac repressorpQG11 上用以驱动GUS基因表现的T5 promoter 的活性将因而受到抑制，但一旦加入IPTG 就能诱导GUS基因大量表现。 在这一节的实验里，我们将分别自经IPTG 诱导与未经诱导的pQG11/M ...

mRNA为单股，一般会卷绕成特定的三级结构，并与某些蛋白质结合，而以messenger ribonucleoprotein particles （mRNPs） 的型式存在于细胞内；自细胞抽取RNA时，一般会以特定步骤去除蛋白质，但仍难完全破除RNA的二/三级结构。 由于进行电泳分析时，影响核酸泳动速率的因子主要包括核酸的长度与构形 （conformation），为了去除核酸构形所造成的影响，一般以电泳分析RNA时都采用变性胶体电泳；在进行这一类电泳分析时，由于RNA已经被变性 （denature），影响其泳动速率的因子主要是长度。 一旦RNA以变性胶体电泳解析好，即可进一步进行北方转印与杂合分析。

甲醛洋菜胶体电泳 （formaldehyde-agarose gel electrophoresis）甲醛是一种常用的RNA 变性剂。在进行甲醛洋菜胶体电泳分析时，必须先配制含有甲醛的洋菜胶体，RNA 也必须先以甲醛及formamide 进行变性处理，以确保其二度结构充分被打开。由于甲醛可能是一种致癌物质，配制胶体及进行电泳分析时都应在抽气橱里小心操作；进行电泳时所使用的缓冲液为MOPS （3-[N-morpholino] propanesulfonic acid）。此外，含有甲醛的洋菜胶体比较滑溜，容易破裂，在移动胶体时应特别留神。由于rRNA 占细胞RNA总量的80~85%,以ethidium bromide 染色后，呈现于胶体上的两个主要RNA色带应该分别是large 与small rRNAs （真核生物为28S 与18S,原核生物为23S 与16S）；散布于small rRNA 附近，呈淡淡smear 的就是mRNAs,这是因为mRNAs 存在量不多，而且长度不一的缘故。长度较短的5S rRNA 及tRNA 等则在胶体下方也以特定色带呈现。

要进行北方杂合反应前，必须先将RNA自洋菜胶体转移至硝化纤维纸（nitrocellulose membrane） 或尼龙膜 （nylon membrane） 上，这一个过程称为转印 （blotting）。 一般常用的方法包括毛细管转移法 （capillary transfer）、真空转移法 （vacuum transfer） 与电转印法 （electroblotting）。 毛细管转移法借助吸水纸吸收转移缓冲液时所产生的牵引力量将RNA自洋菜胶体转移至膜上；要转印完全，起码需要作用6 h以上。 虽然所需花费的时间比较长，以其不须要特别的仪器设备，毛细管转移法目前仍被普遍采用。 若分析RNA时采用变性聚丙烯酰胺胶体电泳，则必须以电转印法进行RNA转印。至于膜的选择，硝基纤维素膜的优点是比较不会产生非专一性反应；不过其一旦被润湿再烘干的后，容易碎裂，不适用于进行多次杂合反应。 尼龙膜的优点是韧性好，与核酸结合的能力也相当强，正可以弥补硝基纤维素膜的缺点，现已成为主流。 一旦将RNA转移至膜上后，即可以利用紫外线照射法 （uv irradiation） 或真空干燥法 （在真空下80℃加热2

北方杂合反应的步骤主要包括： （1） 加入核酸探针，使与固定于尼龙膜上的特定RNA 进行杂合反应； （2） 待杂合反应结束后以含盐缓冲液与SDS 洗掉非专一性结合于尼龙膜上的核酸探针。 进行反应时应注意下列几个问题： a.实验操作过程仍应尽可能避免RNase 的污染； b.反应前应先进行杂合前置反应（prehybridization），以便减少核酸探针与尼龙膜的间的非专一性 ...

如果不是新鲜的（最好在半年之内，-80°或者液氮中冻存的）组织，注意不要反复冻融，从冰冻状态拿到0-4°，注意不要拿到常温，待组织解冻后，用DEPC泡过的剪刀剪一小块组织，称重后，放到预冷的匀浆器中，然后加入一定量的TRIZOL试剂，然后匀浆。注意：速度不要太快，要匀一会停一会，否则由于摩擦产热，RNA遇热会加速降解。如果一次做多个标本的RNA提取，也要这样做，更不能急。后面的步骤和细胞RNA提取一样。

Before starting protocol：1. Measure out 75 mg of oligo dT cellulose into a 2 ml Sarstedt screw cap tubes.2. Make fresh buffers:……

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly（A）+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。由于mRNA末端含有多poly（A）+,当总RNA流径oligo（dT）纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo（dT）纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo（dT） 纤维素柱，可得到较纯的mRNA.

Prepare or collect between 2x107 cells for each mRNA prep （will yield about 10-20μg of mRNA）. If PBMCs from a whole blood sample are to be used, the sample should be prepared with Ficoll-Paque according to the manufacturer's protocol. The isolated PBMCs can then be used in this protocol.