DNA实验技术

首先要感谢DXY上的neohjh等几位热心的战友，没有他们的经验我不会这么快做出该实验引物设计与说明书中不一致，我是参考“An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol”这篇文献设计的。Site-directed Mutagenesis Method1. Primer designThe primer design was according to “QuikChang ...

　　　技术答疑——“血液基因组提取”　张老师，天根特邀专家。分子生物学博士，具有10多年的分子生物学领域的研究经验。熟悉各种分子生物学实验技术。在我们的沟通中，张老师始终强调：“核酸提取是分子生物学实验的第一步，良好的开始是成功一半。”张老师希望通过丁香园论坛，就基因组提取技术方面与大家共同探讨。以下请站友们就“血液全基因组提取”及相关问题跟帖提问，张老师将作阶段性答复。答疑流程1、提问时间：2009.4.15～2008.4.30；2、 ...

欢迎您到核酸基因技术讨论版！如果您是新手，在发贴前先明确目的！丁香园的原则是互相帮助，共同进取。如果觉得可以帮助他人，回帖即可。====1.我如何在这个版块得到我需要的信息？===如果你要在本版获取资料，请先检索本版，以节约您的时间和资源，不要盲目发帖，忽视【搜索本版】以及【精华区】的功能，另外请注意旧帖整理和FTP资源为你提供了便利，相信可以节省你的宝贵时间，上面可能有您急需的资料。如果你想了解其他地方你可以了解得更详细。== ...

祝贺gb2003、wh2008成为《实验技术中的惑与获》一书主编！期待他们的作品早日问世！*****************************************************************************主编征集活动回顾：全园征集主编：丁香园联手人民卫生出版社打造《实验技术中的惑与获》一书在实验过程中，你是否曾经有过诸多“困惑”？在消除困惑的过程中，你取得了哪些“收获”？和大家分享你在实验过程中的惑与获，启示后来人！ 实验技术的设计和操作是一个不断探索与 ...

20个测序常见的问题1．为什么需要新鲜的菌液？首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。2．如何提供菌液？如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以将培养好的4～5ml菌液沉淀下来，倒去上清以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。3．如何制作穿刺菌？用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全 ...

第三代测序技术简介 转自sciencenet 作者 廖新化如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了！这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序）。我有幸在 ...

摘要:腺相关病毒(AAV)是一种人细小病毒，目前因为能作为一种基因治疗载体而受到广泛关注。构建重组AAV(rAAV)涉及到用一个目的基因替换病毒基因组的大部分，然后将这个重组基因组包装到一个有感染性的病毒颗粒里。目前大多数生成rAAV的实验方案需要共转染一个载体质粒和一个表达病毒复制和结构基因的包装质粒到腺病毒(Ad)感染的培养细胞中。此方法的局限性包括(1) Ad辅助病毒污染rAAV，(2)rAAV的低产出，(3)生成 ...

酶切反应建议一、 建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。二、 选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA ...

Q1: 抽提DNA 去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好?A1: 酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变 性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性剂的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定 ...

原理： 如何获得高的大肠杆菌感受态——可算是【一块砖头】吧 感受超级感受态细胞的制备 感受超级感受态细胞的制备1 超级感受态制备2 E.coli感受态：一步法制备感受态： 一步法制感受态急－关于感受态细胞 关于一步法制感受态的疑问 我所用过的最简单的制备感受态的方法！CaCl2法： 感受态细胞的制备 【鸡毛蒜皮】之6 Ultra-感受态 交流：大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法 因为最近数次制作感受态转染生长失败，求助精英们的标准制作方法。多谢！ 分子克隆第三版中感受态 ...

基因组编辑三大工具ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9筛选基因敲除细胞系阳性克隆Protocol 上海南方模式生物研究中心 技术顾问 周效华从2011年科学家实现TALEN技术，2013年科学家实现CRISPR/Cas9技术，这些技术的迅速成熟都给基础生物学研究、临床医学研究提供了更为方便和快捷的分子生物学工具。技术进步必将在未来给科学研究及基因治疗研究带来更为广泛的发力！这在2014年以来的频频出现的Cas9 ...

玛丽和乔是一对孪生子，她们拥有相同的遗传学特征而且共同生活在一个幸福的家庭里。随着他们的不断成长，两个人都非常喜爱体育和艺术，同样学习成绩优良而且几乎在每一个方面哪怕是细节方面都显示出了惊人的相似。然而等到成年以后，她们的生活和个性却产生了明显的差异：在玛丽二十岁出头的时候，一件恶梦般的事情发生了，她被诊断患有精神分裂症。类似这样的例子长期以来一直使遗传学家们感到困惑：尽管拥有相同的DNA甚至常常是同样的成 ...

非常感谢lewis 1121！！！另外在论坛中找到部分关于滤纸上质粒溶解提纯保存的方法，贴在这里，供同道参考。（没有进行系统整理，也未按原发贴顺序，详情还请见原文）请问：如何从滤纸上洗涤下质粒DNA？(dxyshining )我是这样做的,加入PH8.0 TE,边加边用枪尖压实滤纸,直至确认能吸出一点液体,然后用这液体去做转化.记住要留出点呵.滤纸也不要马上扔掉. (楚风)4度下TE浸泡过夜,次日即可使用....(roger )１。滤纸有质粒部 ...

第一节 基因和基因组一、基因(gene)是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列．一个典型的真核基因包括①编码序列—外显子(exon)②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron)③5'-端和3'-端非翻译区(UTR)④调控序列(可位于上述三种序列中)绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。二、基因组(genome)一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基 ...

本人做的植物转基因技术方向，由于要做一些杂交技术来验证外源基因的整合与表达情况，故将自己在做实验中遇到的一些问题以及注意事项想告诉大家，同时希望和朋友们一起交流探讨。Southern Blot:1.首先是提取大量DNA，由于不同的材料的基因组大小不一样，故上样量也不同，但上样量还是要大一些为好，一般30-50微克左右，若你的DNA质量非常好，一般20微克左右就可以，有的材料如獐茅10微克就可以。注意，上样量与DNA质 ...

原位杂交的基本方法一、组织的取材注意事项：刀要锋利、不能用力向下挤压组织； 组织块不宜过大、及时固定。二、固定（一）原则：及时固定、避免RNA酶的污染4％多聚甲醛（0.1M PBS PH7.4，可加1/1000的DEPC）,动物实验标 本最好先灌流固定。（二）固定液的浓度、固定时间及温度要适宜1 浓度越高组织结构保存的越好，但mRNA的保存越差；2 固定时间越长，mRNA破坏的越多；做原位杂交组织固定时间不宜过长，一般24h，不能高温固定（微波可使组 ...

第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第一节 概 述　　把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 　　质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所 ...

目的:构建目的基因的真核表达载体 历时整整一学期,期间经历了很多挫折,遇到很多问题,也从中学到很多经验.借寒假的时间写了写我一学期构建的经历,把我的一点经验拿出来和大家分享讨论.分步来说:一.PCR扩增得到目的片段1.引物的设计与合成:这里有很多血与泪的教训。我前后一共送过九个载体测序，其中居然有五个是引物出错。最后一次挑的两个克隆都是上游引物出错（此上游引物40个碱基） ，后来和这家引物公司交涉，他们拿走了我的板子，一次 ...

《分子克隆参考》编写已经进入收稿阶段，请各位战友抓紧时间编写，计划在年底前出书，收稿截止至12月15日。已经PM给报名参加撰写的战友，请将文稿用word发送至我的邮件，或以附件形式贴在跟帖中。同时希望你们在以下贴中回帖，以便加分（初步定为5分）和核实内容，违期将示为自动放权，谢谢您的合作！请各位斑竹根据目前收稿情况选择几章较熟悉的，然后我再具体安排章节进行校正审稿，特殊章节（不属于实验技术范畴）再讨论，也请战友投稿 ...

上海莱枫生物科技有限公司 网址：www.lifefeng.com订货电话：021- 64810180,25966877 传真：021-54252754技术解答：shanghai@lifefeng.com 技术支持：400-600-1087,13817902990(上海)各位战友如有需要我们可提供4次免费试用装个人认为彻底去除细胞DNA是实验可重复性的关键，后续PCR添加BSA或Carrier DNA或增强剂是非常有必要的。我们旨在提供 ...