DNA实验技术

1. 质粒制备的基本原理是什么？ 答：做过分子生物学实验的大多数做抽提过质粒，但不是所有人都知道质粒制备的基本原理。所以有必要做一个说明，能帮助您了解和解决实验过程中遇到的一些问题。制备质粒最常用的方式是碱裂解法。质粒被转化到细菌中，单菌落接种到含有特定抗生素的培养基中，一般培养到细菌生长的平台期离心收集细胞；细菌用悬浮液（Solution I 内含RNase A）悬浮细胞，用SDS-NaOH ...

快速细胞破碎法实验步骤： 1、 挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中，37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8。 2、 取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。 3、 加入70μl Cracking Gel缓冲液20%SDS 10ml，250mmol/L EDTA 1.6ml蔗糖27.2g，1.2%溴酚蓝1.67ml，加双 ...

1. Pick a single colony from a streak plate and inoculate 25 ml of LB with appropriate antibiotic. Incubate overnight. 2. Get an ice bucket ready and put buffer P3 (stored in 4℃) in it. Pour the cultu ...

本方法由DellaportaWood和Hicks(1983)的方法修改而成。其基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后，加入高浓度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质，最后用乙醇或异丙醇沉淀。 一 材料、试剂和仪器 1 材料 新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料 2 试剂 (1)提取缓冲液 Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0） EDTA 50mmol/L （pH8.0） NaCl ...

限制性核酸内切酶 ：识别DNA特定序列，切断DNA链 ； DNA聚合酶Ⅰ： 或Klenow 1、缺口平移制作标记DNA探针； 2、合成cDNA的第二链； 3、填补双链DNA3’凹端； 4、DNA序列分析耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等） 聚合酶链反应（PCR）； DNA连接酶： 连接两个DNA分子 ； 多核苷酸激酶 ：催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端标记探 ...

一 酶切和电泳 在200 μl 微量离心管中加入： 25 μl DNA样品(约10μg)， 3μl 限制性内切酶（MBI，10 U/ μl） 5 μl 相应的10×buffer， 补水到50μl。 然后加一滴矿物油覆盖 稍微离心后放于37℃水浴8-12小时。酶切完后，取5μl 酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上检测酶是否充分。如果酶切 ...

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列; 另一 ...

Adapted from Frommer et.al.* 1.Dilute DNA (up to 2 mg) into 50 ml with distilled H2O. 2.Add 5.5 ml of 2M NaOH. 3.Incubate at 37℃ for 10 minutes (to create single stranded DNA). 4.Add 30 ml of 10 m ...

Purp ...

限制和修饰现象在上个世纪中期被人们所发现，到 2005年1月，已经发现4342 种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有3681 种。限制性内切酶有特定的识别位点和切割位点，切割后可产生平末端或粘性末端。酶切有标准的反应体系，受末端长度的影响，有位点偏爱性，在极端非标准条件下会产生星星活性。通过酶切连接可以增减酶切位点，酶切位点在基因组中的分布是不均匀的。大肠杆菌有三种甲基化酶和三种依赖于甲基化的限制系统 ...

一．原理 (1) 以目的mRNA 为模板，使用Oligo dT-3sites Adaptor Primer 进行反转录反应，合成1st Strand cDNA。 (2) 使用含有KpnI、XbaI、BamH I 酶切位点的上游特异性引物和3sites Adaptor Primer进行PCR反应。 (3) 使用限制性酶（KpnI、XbaI或BamH I）对PCR产物进行酶切反应。 (4) 选用适当载 ...

10X TBE per liter Sequencing dye ------------------- ---------------- &nb ...

Application of Electroporation in Gene Transfer and Animal Embryo Cloning 郝新保 范清宇 Hao Xin-bao Fan Qing-yu 第四军医大学全军骨肿瘤研究所 西安 710038 Institute of Orthopedic Oncology Fourth Military Medical Universit ...

Hey everybody I am working on a side-directed mutagenesis with the Stratagene℃ quickchange mutagenesis xl-kit. Here is my problem: My plasmid is 17kb big. Until now I have had no colonies on my plate. ...

对某文库全部片段进行末端序列测定中未测到的碱基数，即缺口(gap)，与已测定的总碱基数相关。随着已测定碱基数的增加，缺口的总碱基数目会按照泊松公式的一个推论（P=e-m ）迅速减小。其中P为中某个碱基未被测定的概率，m为所测定的碱基数与大小相比的倍数。m越大P值越小。当m值达到5（即随机测定的碱基数达到5倍时），基因组中未测定的碱基数为总碱基数的0.67%(e-5 =0.0067)。对流感嗜血杆菌 ...

Paula Marquardt & Craig Echt Published in: Echt CS May-Marquardt P Hseih M Zahorchak R. 1996. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome 39:1102-1108 . comments can b ...

Hello group! I want to insert a small 30 bp sequence into a vector of mine using ds-oligo. I've created the oligos so that once annealed they have the correct overhangs of the restriction sites. As I' ...

DNA片段的克隆需要合适的载体，载体或是质粒，或是噬菌体，或是病毒，通常大多经过人工改造一、质粒 常用的有pBR322，pUC系列质粒等。 （一）pBR322质粒是4362bp的环状双链DNA载体，有2个抗药性基因（四环素和氨苄青霉素），一个复制起始点和多个用于克隆的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转化时，它便从该质粒获得了抗生素抗性。两个抗生素基因中均含供插入外源DN ...

Caltech Genome Research LaboratoryCalifornia Institute of Technology http://www.tree.caltech.edu/protocols/agfp.html Restriction digests consist of: 15.75 ml ddH2O 1 µl 10 X buffer B (Boehring ...

Caution: EtBr is a powerful mutagen and is moderately toxic. Wear gloves when working. When EtBr conc. is >0.5 mg/ml: 1.Add sufficient water to reduce the concentration of EtBr to <0.5 mg/ml. ...