DNA实验技术

物理显影液的配制：硝酸银显影液、乳酸银显影液、醋酸银显影液、彩色显影剂的配制、漂白液的配制、定影液的配制、缓冲液。

DEAE membrane吸附法分离与纯化DNA片段利用离子交换的原理，在低盐情况下使DNA 吸附在带正电荷的滤膜上，再利用含有高浓度盐类的缓冲液将DNA 自膜上溶离下来。

Silica gel吸附法分离与纯化DNA片段：经BamHI 及HindIII 作用的pBlueGus 及pQE31,置于65℃水浴10 min，移至冰浴降温后，以含EtBr 的1.0% agarose gel 进行电泳 （两种样品各用六个wells,每个well 注入30 μL 样品）。

DNA 的定量与连接反应：纯化的gusA 片段与经BamHI/HindIII 作用的pQE31 片段混合后，末端序列互补的部份会进行黏合，但仍须藉由DNA ligase 催化phosphodiester bond 的形成，将缺口接合起来。

X-Gluc 可被GUS作用而释出蓝色的产物，若转型株所带的质体接有gus 基因的重组质体，则应可在IPTG 的诱导条件下表现出蛋白质，若此重组蛋白质具有GUS 活性，可将进入菌体的X-Gluc 分解而使菌落呈蓝色

这个方法是以phenol 及chloroform 溶菌后直接进行电泳分析，并未将质体DNA与宿主细菌染色体DNA 分离，得到的DNA 也不能用限制酶作用。

在胶体中的DNA 可利用毛细现象的作用将DNA 牵引转印至覆盖在胶片上的滤膜，经烘烤或UV 照射后，可使DNA 固定在膜上，以进行探针的杂合（hybridization） 反应。

以phenol/chloroform 进行DNA 萃取：进行这一部份实验的前，请先确定pBlueGus/HindIII 与pBlueGus/BamHI 两者的酵解反应都已经完全。

DNA实验室的故事之一：远古DNA

老外教你跑胶（琼脂糖凝胶电泳）

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进行杂合反应时所使用的探针若为放射性物质所标定者，杂合讯息可经由放射显影术 （autoradiography） 侦测出来；若为DIG所标定者，则需借助anti-DIG抗体与碱性去磷酸酶 （alkaline phosphatase, AP） 的conjugate,并利用碱性去磷酸酶的酵素活性转现杂合反应讯息。 目前常用来进行碱性去磷酸酶呈色反应的基质为NBT （nitroblue tetrazolium） 与BCIP （5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,toluidinium salt）； 此外，也可以选用CSPD或CDP-Star等试剂，以增加检测敏感度。

电泳分析

引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪，合成长链主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成仪，引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。

根据植物矿质吸收的理论，植物对溶质的最初吸收具有吸附的特性，并假定这时在根系表面均匀地覆盖了一层被吸附物质的单分子层，因此可以根据根系对某种物质的吸附量来测定根的吸收面积。常用甲烯蓝作为被吸附物质，它的被吸附量可以根据供试液浓度的变化用比色法准确地测出。已知1mg甲烯蓝成单分子层时所占面积为1.1m2，据此即可求出根系的总吸收面积。当根系在甲烯蓝溶液中已达到吸附饱和而仍留在溶液中时，根系的活跃部分能把原来吸附的物质吸收到细胞中去，因而继续吸附甲烯蓝。从后一吸附量求出活跃吸收面积，可作为根系活力指标。

核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。

PFEG（Plused-Field Gel Electrophoresis）技术是将细菌完全包裹在一种特殊的琼脂中，然后加入一些化学试剂，比如十二烷基肌氨酸钠，蛋白酶K等，将细菌中的蛋白成分全部溶化，消化，只剩下整个序列的DNA。经稀有限制性内切酶消化后，切割成大小不等的片断，然后将其置于脉冲场电泳槽中电泳，完成片段分离的过程。经染色脱色后，在读胶仪上显现酶切后的电泳图谱，并经统计软件的分析，即可判断出条带的不同，同时做出细菌的同源性分析，从而达到分型的目的。其中能影响电泳图谱的参数很多，如电泳的转换时间，电泳的总时间，电泳的角度，电压，电泳液的温度等等，且不同的参数会得到不同的电泳图谱。

（1）消化细胞后以1500r/min离心，去上清后重悬于冰冷的1×TBS中，再次离心加入0.5ml提取缓冲溶液（RNA酶临时加入），移入EP管中。（2）37℃孵育1h，加4μl蛋白酶K/ml，50℃孵育3h。……

利用亚精胺对含多糖、多酚类物质较多的植物、真菌等材料的DNA进行纯化，以去除杂质，利于后续试验。1、加入400mlTris-HCl（100mM 8.0），溶解DNA……