DNA实验技术

无水的单个核苷酸分子量为： A= 313.21 T= 304.2 C= 289.18 G=329.21 粗略估计，通常四个碱基的平均分子量，一个DNA 核苷酸（在盐溶液中）的平均质量为325道尔顿。 MW of a single-strand DNA molecule= （#of bp）× （325 ...

基因转染是将具生物功能的核酸（RNA或DNA）转移或运送到细胞内，并使核酸在细胞内维持其生物功能的核酸转移技术。转染技术的目的是主要是研究真核基因的表达和调控，目前的方法包括磷酸钙共沉淀法，电穿孔法以及同DEAE-dextran或阳离子脂质体试剂形成复合物法。 在这些不同的方法中，DNA转导的效率，转导的机制，可重复性及使用的方便性都存在差异。而且，有效的DNA转导会伴随某些毒性或细胞抑制，其 ...

组织培养试剂 一般提示：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并经可能减少所用试剂的变更。 基础培养基—目前所使用的各种市售培养基（如，RPMI 1640和DMEM）。培养基的成分包括营养物质（氨基酸，葡萄糖），维生素，无机盐，和缓冲物质。有些成分非常不稳定，因此如果不在使用时新鲜加入就可能会产生问题。务必要使培养基避光保存。因为已知有一些组分和缓冲物质 ...

LucidaGrande Lucida Helvetica Arial sans-serif;"Gibson Assembly is a high-efficiency DNA end-linking technique developed by Daniel Gibson at the JCVI in 2009 83 106); font-family: 'Lucida Grande' Lu ...

一、荧光原位杂交技术发展历史 1969年，Gall，Pardue和John等人，分别独立建立了同位素原位杂交技术。 1974年，Evans，第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来，提高了基因定位的准确性。 1975年，Manning等人，最先在溶液的分子杂交中，使用非放射性标记，通过细胞色素c将生物素与RNA分子连接起来。 1977年，Rud ...

一、荧光原位杂交（FISH） 是一种简单、敏感、而容易操作的方法，结果迅速，并能在同一标本上检测多个不同的基因，可应用于细胞培养、染色体分裂像、冰冻切片和石蜡切片。 FISH技术是利用特异的DNA探针，标记了生物素，地高辛、或荧光素，对检测细胞进行DNA-DNA原位杂交，并用荧光法显示。 FISH实验步骤 试剂配制： （1）变性液（70%甲酰胺 + 2×SSC，pH7.0）：4 ...

一、预处理 1. 脱蜡至水 （1）二甲苯5分钟，2次 （2）100%酒精1分钟，2次 （3）95%酒精1分钟，1次 （4）85%酒精1分钟，1次 （5）双蒸水1分钟，3次 2. 加热预处理 （1）热预处理液（试剂盒内带）加热至98-100℃时，放入切片，15-20分钟。 （2）双蒸水洗1分钟，3次 3. 胃蛋白酶消化 （1）将胃蛋 ...

一、地高辛（Dig）标记DNA探针在石蜡切片上的检测方法 1. 组织切片的预处理 （1）固定：组织以10%中性福尔马林液，常规石蜡包埋，切片厚4-6 μm，最好用硅化玻，60℃烤片6-8 h。 （2）脱蜡至酒精。 （3）入0.2 mmol/L HCl 20 min 去除蛋白。 （4）50℃2×SSC，含5 mmol/L EDTA溶液中30 min。 （5）蛋白酶K（ ...

基因组DNA提取是最基本的分子生物学实验技术，是做各种核酸实验的基础。不同生物的基因组DNA提取方法也会有所不同。

本法可使抗体或其它蛋白质的ε-氨基通过手臂与酰化的生物素共价结合。其后，生物素化的分子可应用酶标-亲和素或荧光染料-链霉亲和素复合物来检测。小分子的水溶性生物素对细菌蛋白链霉亲和素具有高度亲和力是本法的设计基础。 NHSB：N-羟基琥珀酰亚胺生物素（有商品供应） 0.1 mol/L 碳酸氢钠缓冲液，pH 8.0 双蒸水（注意去除游离氨基），用以配制碳酸氢钠缓冲液或硼 ...

下面的操作方法可以使约3~5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。 1. 溶解2~10 mg 蛋白于1 ml 的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。 ...

RNA转录物能通过琼脂糖变性胶电泳检测其探针完整性。标记效果可通过抗DIG碱性磷酸酶直接检测，有两种方法可以选择。 方法一、用标准DIG测试条比较鉴定 使用测试条鉴定包括两个步骤：首先，将转录标记的RNA稀释成一系列的浓度，并点样到空白测试条上（对照测试条已用一系列浓度点样）；其次，将点样的备测试条与对照测试条一起进行免疫、显色反应，然后根据对照测试条计算备测样品的浓 ...

PCR可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过对光密度扫描来进半定量的分析。无论定性还是半定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。 例如我们想知道某一特定基因在特定组织中的表达量。早期定量PCR技术需要特别的训练，严格的测试和特别准确的加样。早期定量PC ...

一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有 ①模板核酸的制备。 ②引物的质量与特异性。 ③酶的质量及。 ④PCR循环条件。 寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板： ①模板中含有杂蛋白质。 ②模板中含有Taq酶抑制剂。 ③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白。 ④在提取制备模板时丢失过多，或吸 ...

引物（Primer）在聚合作用的起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中，引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。 自然中存在有生物的DNA复制引物（RNA引物）和聚合酶链式反 ...

1. 如何测定引物的OD值？ 用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2~0.8之间（吸光度太高或太低会有较大的误差）。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1 ml 并在1 ml 标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。 举例：您拿到一管干粉的DNA ...

引物（primers）： 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。引物的重要性：在整个PCR体系中，引物占有十分重要的地位。 引物的重要性： 在整个PCR体系中， 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能 ...

一、GC% GC含量 对于PCR反应来说GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适；而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。产物中GC含量最好大于引物中的GC含量。 二、Degeneracy 多义性 当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，应尽量避免3‘末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。 三、3&rsqu ...

1、引物延伸分析（primer extension analysis） 引物延伸分析用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端， 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域，随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5`末端间的碱基数 ...

1. 在收获组织及细胞死亡之后，应立即灭活内源的RNA酶，以防止RNA降解。 以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活： （1）用含离液（如胍盐）的细胞裂解液收获样品，并立即匀浆。 （2）用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是：组织块必须保证足够小，在浸入液氮的瞬间就能冻结，以确保瞬间令RNA酶失活 （3）立即将样品置于RNAlater? Tissue Collection：RNA St ...