更多资讯

今天，笔者就以一篇 SCI 文章为例，带各位小可爱看一看怎么才能更快 GET 一篇近期发表的生信分析文章中主要讲了些什么，以及我们该如何学习大佬的思路并化为己用。今天，用来举例的这篇文章是发表在 International Journal of Molecular Sciences 的A Comprehensive Bioinformatics Analysis of UBE2C in Cancers（DOI：10.3390/ijms20092228），影响因子在 4.5，是纯生信文章中还不错的分数辣。至于为什么又是肿瘤？别问，问就是肿瘤撑起了生信分析文章的四分之三壁江山。当然，在读文章和读图之前我们还是要对文章进行一个概念化的认识。通过大致阅读摘要，我们可以获知：UBE2C 是一种泛素化的共轭酶，作者通过两个数据库——TCGA 和 GTEx，发现这个酶的表达和肿瘤的不良预后相关，并且筛选出了一些之前不太有研究的、和 UBE2C 相关的一些基因靶点。在这里笔者提出一个小建议，各位小可爱不妨在读完摘要后，代入自身视角先思考一下：如果是你们进行这项研究，会通过哪几部分结果，用什么样的分析方

所有的返修，都需要认真对待。在现在生信 SCI 越来越多的情况下，审稿人很容易对千篇一律的稿件产生疲劳，所以能有返修意见已经蛮不容易，说明最起码一堆投稿的 SCI 中，你的稿件相比其他人的稿件，have the priority to be published～ 那好不容易有返修意见后，该注意哪些事项呢？ 注意事项 1：注意返修有无 Deadline 及具体 Deadline 时间准时，是科研人士的「基本素质」，若需要补实验等，需要提前询问编辑申请延期（如无必要尽量加班加点补完就好）。然而有的同学临近截止时间了，返修意见也不回复，直接就申请延期... 当然，实在来不及需要多点时间是可以理解的，可以其他返修意见尽善尽美回复完后，需要补实验延期的意见里以及给编辑回复里再额外申请下延期。这样审稿人可以先看其他问题再提出下一轮意见（如果有的话），这样整体也不会延误进度，也能向对方表示出我们确实有认真修改的态度和决心。另外，如果本身 Deadline 就给 1-3 周的时间，大概率是小修了。如果是 1-3 个月的时间，大概率是大修。大小修给的时间不同，是否补实验、补多少等问题是可以反过来参考对方

相当多的蛋白质行使功能的时候并不是单打独斗的，蛋白质们通过蛋白质相互作用形成复合体然后进行工作，在工作的过程中，蛋白质们也可以通过更换相互作用的伙伴，从而改变蛋白质复合体的功能。因此，研究蛋白质的相互作用成为研究蛋白质功能和作用机制的最为重要的环节之一。另外，蛋白质相互作用的本质其实是三种力，氢键，分子间作用力（范德华力）和疏水力，因为这三种力的作用距离都非常的短，所以相互作用的蛋白我们通常认为它们必定相互接近，尽管这是个充分非必要命题，但是我们常常使用这个命题的逆命题来进行实验检测。那么，如何对这个问题进行研究呢？这里狗哥就带大家简单梳理一下常用的蛋白质相互作用的研究方法。图 1<1>酵母双杂交，Yeasttwo hybrid（Y2H）, 这是一个古老的技术，Stanley Fields 和 Ok-KyuSong 在 1989 年的时候利用大肠杆菌中 GAL4 乳糖操纵子的原理，开发出这个方法用于检测蛋白质之间的相互作用 。GAL4 操纵子有两个结构域，BD（binding domain）结构域和 AD（activation domain），其中 BD 结构域可以结合在

最近 WB 的结果趋势不是很理想，因为给了蛋白 B 的抑制剂蛋白 B 却没有明显变化。于是大伙儿一合计，可能需要再看看蛋白质之间的相互作用，会不会是抑制剂影响了蛋白 B 和蛋白 C 之间的结合，而不是直接导致蛋白 B 的降解。大家都知道研究蛋白质相互作用的三大经典方法是：酵母双杂交（Y2 H），免疫共沉淀（CoIP）和 GST pulldown。结合我们课题组的这个实验，因为只需看看蛋白 B 和 C 之间的结合，而且已知蛋白 B 和 C 是会结合的，所以可能用 CoIP 最简便。首先我们得了解一下 CoIP 的原理，其实和 WB 一样，就是抗体抗原结合的免疫反应，只要你会 WB，就能轻松理解 IP 和 CoIP 的原理。简单来说，如果蛋白 B 和蛋白 C 结合的话，那么用抗体去结合蛋白 B 的时候，蛋白 C 就能被拉下来。大家知道抗体的结构是一个 Y 字形，两头是 Fab 用于识别抗原，尾巴是 Fc 区域，这个 Fc 区域就能结合 Protein A 或 G。自从磁珠出现之后，CoIP 的操作就变得更加简单了，只需要用包被 Protein A 或 G 的磁珠先和抗体结合，然后用抗体磁珠

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。它可以：测定两种目标蛋白质是否在体内结合；确定一种特定蛋白质的新的作用搭档；分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 一、实验原理当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X，那么与 X 在体内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。目前多用精制的 prorein A 预先结合固化在 argarose 的 beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的 prorein A 就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 二、实验步骤免疫共沉淀反应：1. 转染后 24～48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解 30 min，细胞裂解液于 4 °C，最大转速离心 30 min 后取上清。2. 取少量裂解液以备 Western blot 分析，剩余裂解液加 1 μg 相应

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂。 一、工作液配制配制 100 ml 的 modified RIPA buffe：1.称取 790 mg 的 Tris-Base，加到 75 ml 去离子水中，加入 900 mg 的 NaCl，搅拌，直到全部溶解，用 HCl 调节 PH 值到 7.4；2.加 10 ml 10% 的 NP-40；3.加 2.5 ml 10% 的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清；4.加 1 ml 100 mM 的 EDTA，用量筒定容到 100 ml，2～8 ℃ 保存；5.理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽, 胃蛋白酶抑制剂各 100 μl；PMSF，Na3VO4，NaF 各 500 μl），但是 PMSF 在水溶液中很不稳定，30 分钟就会降解一半，所以 PMSF 应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定 5 天。 二

你是不是每次做纯化实验心里都会默念：退！退！退！有关纯化实验的所有问题都退！感觉像是在作法而不像是在做实验。虽然蛋白纯化被认为是考验基本功的实验，但接踵而至的考验只会让原本不熟练的实验雪上加霜，导致纯化实验失败了一次又一次……失败原因五花八门，比如：标签蛋白纯不出来，过了分子筛跑 SDS 胶还一堆杂带？面对着样品的精细分离，却不会选层析柱？纯化得到的组分中没有或只有少量目的 His 标签蛋白，知道了蛋白等电点却不知如何选择离子交换层析......遇到这些问题别担心，「纯化密卷」来帮忙！！在这份 CIPP（Capture, Intermediate purification，Polishing，层析策略）纯化密卷中，我们对大家纯化过程中遇到的常见问题，一一做出了解答，更有九大层析策略，让专业的人帮你搞定一切困难～生物分子间的分离纯化主要依据分子间在物理和化学性质上的差异来实现的，包括大小、电荷、疏水和极性等，部分蛋白还具有特殊的亲和特性。另外，可以综合利用多种不同的性质差异，采用特殊的「多模式填料」进行分离。每种层析技术各有优势和特点，「组团出道」才能到达最佳的纯化效果。希望通过这份密卷

免疫亲和层析法常用于蛋白质等生物大分子的纯化。但你是否想过，一根亲和层析柱子也能用来进行细胞分选，而且还不使用高亲和力抗体？在细胞分选中，我们常常利用免疫识别特性来进行，比如流式分选(FACS)和免疫磁分选(MACS)。免疫细胞的划分是依据表面标志 CD 分子，可以被抗体识别。比如针对 CD4 + T 细胞这一特定类群，表面含有 CD45、CD3 和 CD4 标记。而表达 CD4 就是辅助性 T 细胞的特征。由此而来，免疫磁分选利用特定抗体偶联磁珠来捕获细胞。细胞与磁珠结合后，再利用磁分离器来分选。但具体选用何种方法，还是要看下游的研究。如果，想在选出的 CD4 + T 细胞上做基因功能研究，就不能采用会影响靶细胞基因表达或者会刺激细胞的方法，还得获得大量高纯度、高活力的细胞。而高亲和力抗体的使用，则不免对细胞产生刺激。如果为了避免刺激细胞，不使用高亲和力抗体，细胞分选该如何进行呢？无踪免疫亲和层析(TACS)细胞分选对于这个问题，来自德国 IBA Lifesciences 的团队考虑到了亲和层析法。 进行蛋白纯化最常用的方法之一，是亲和层析法，借助标签和配体的亲和力进行蛋白纯化。纯化

2021 年 3 月 10 日，浙江大学基础医学院柯越海教授团队在 Journal of Extracellular Vesicles 杂志在线发表了题为 Phosphatase Shp2 regulates biogenesis of small extracellular vesicles by dephosphorylating Syntenin 的研究论文。 该研究发现一组酪氨酸磷酸酶调控细胞外囊泡 (extracellular vesicles) 的合成与分泌，阐明了其中的磷酸酶 PTPN11/Shp2 通过去磷酸化修饰负向调控肺泡上皮细胞外泌体的生成，提示了磷酸酶参与肺部炎症微环境的新的作用途径。外泌体 (Exosome) 是细胞外囊泡的一种主要形式，基本结构为 20-200 nm 的纳米级膜结构，近年来研究显示外泌体是细胞间信息传递的主要载体，在生理或病理条件性，外泌体合成与释放可介导各类生物活性分子传递，广泛参与调控疾病发生发展进程，解析外泌体调控机制有望深入理解复杂微环境信号转导的共性特征。磷酸化效应是信号调控的重要的翻译后修饰方式，是解析分子机制的生化基础，也是药物

细胞自噬是从单细胞酵母细胞到复杂多细胞生物的所有真核生物中高度保守的细胞内降解代谢途径。自噬对细胞应对营养缺乏等多种应激条件具有至关重要的作用，与多种疾病如神经退行性疾病、衰老、肿瘤和炎症等密切相关。细胞自噬的分子过程受到多种蛋白质翻译后修饰的调控。蛋白质赖氨酸乙酰化修饰已经被广泛发现可以动态、有效的调控自噬的活性。此外，蛋白质赖氨酸乙酰化修饰在自噬以外的其他生物学过程中也发挥重要调控作用。不同于蛋白质赖氨酸乙酰化修饰（乙酰基团共价连接到赖氨酸侧链氨基），蛋白质 N-端乙酰化修饰是指乙酰基团共价连接到蛋白质第一个氨基酸主链氨基。已有研究对蛋白质 N-端乙酰化修饰的功能和分子机制的探索相对较为薄弱。2021 年 11 月 16 日，四川大学卢克锋研究员团队联合四川大学生物治疗国重李绘绘副研究员团队和四川大学华西医院戴伦治教授团队在在《Cell Reports》杂志在线发表题为 Function and molecular mechanism of N-terminal acetylation in autophagy 的研究论文，该研究揭示 B 型蛋白质 N-端乙酰化修饰特异对自噬途径的

DNA 双链断裂可由外在因素（电离辐射和活性氧等）或内在因素（DNA 复制错误和 V（D）J 重组等）造成，从而激发 DNA 损伤应答，包括 DNA 修复、细胞周期调控、细胞衰老和细胞凋亡等。DNA 损伤应答由 PIKK（phosphoinositide-3-kinase-related kinase）家族蛋白激酶催化下游蛋白的磷酸化而启动，包括 DNA-PK（DNA 依赖性蛋白激酶）、ATM（Ataxia Telangiectasia Mutated）和 ATR（ATM-Related and Rad3-Related）三种激酶。其中，DNA-PK 是非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）通路中的关键蛋白激酶，由 DNA-PKcs（DNA-PK 催化亚基）、Ku70/80 和 DNA 末端组成，其全酶装配会进一步招募 NHEJ 相关的连接酶和修复蛋白，包括 DNA 连接酶 IV、XRCC4（X-ray cross complementing protein 4）、XLF（XRCC4-like factor）和 Artemis 等。由于激酶结构

胃癌（GC）是全世界最常见的恶性肿瘤之一，发病率居全球恶性肿瘤第 4 位，病死率居全球恶性肿瘤第 2 位。这种癌症预后差，治疗选择也相当有限。我国是真正的「胃癌大国」。尽管早期诊断技术、手术、放化疗以及免疫治疗技术的进步，但胃癌发病率和死亡率仍然居高不下。因此，普及胃癌早筛技术、探索胃癌演进的分子机理，为寻找新的胃癌分子靶点和治疗策略具有重要的价值。mRNA 修饰被认为在基因表达转录后调控过程发挥重要作用。目前研究表明 mRNA 上存在着广泛的化学修饰，如 m6A、m5C、m1Am、ac4C 等。其中， 2018 年 Arango D 等人首次报道了 mRNA 上存在 ac4C，也就是乙酰化修饰方式，功能上它可促进 mRNA 翻译上调 mRNA 稳定性。但目前在癌症领域尚未见 mRNA 乙酰化修饰的相关报道。2021 年 5 月 3 日，兰州大学第一医院李汛教授课题组在 Signal Transduction and Targeted Therapy 杂志上在线发表 NAT10 promotes gastric cancer metastasis via N4-acetylated C

在骆驼科动物外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区（VHH）和两个常规的 CH2 与 CH3 区，不像人工改造的单链抗体片段 (scFv) 那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。单独克隆并表达出来的 VHH 结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH 晶体为 2.5nm，长 4nm，分子量只有 15KDa，由于其尺寸处于纳米级别，也被称作纳米抗体（Nanob ...

WB 实验常常让人头疼，不是没结果就是趋势不对，即使做了很多优化调整，结果却仍不尽人意。这是因为我们的关注点往往是 WB 步骤有没有出错，而从来没有部署过 WB 的全局。其实做 WB 前，我们需要做一次 WB 设计！没错，临床试验需要设计，WB 也需要设计，只有把整体的实验设想进行合理地规划才能获得最佳的实验结果。那如何做 WB 设计呢？ 第一件要做的事情就是知己知彼！ 一、了解你的目标蛋白我们首先需要收集目标蛋白以下信息：1. 目标蛋白的名字2. 目标蛋白在哪些组织中表达，是否具有特异性3. 目标蛋白的分子量4. 目标蛋白在细胞中的表达位置及表达量5. 是否有相应的抗体如何获取这些信息呢？除查询文献外我们可以借助生物信息学方法及一些产品信息获取相关信息。例如使用 Uniport，维基百科，NCBI，ExPASy 等进行查询。还可以通过相应抗体产品提供的信息进行查询。了解了目标蛋白以上内容后，我们就可以开始做 WB 设计啦！ 二、WB 方案设计1. 首先明确实验目的，为什么要做这个 WB 实验？要验证哪些问题？例如：是想验证目标蛋白的表达情况？还是要验证目标蛋白在细胞几个不同组分中表达

「救命！做 WB 蛋白样品提取时，样品加入裂解液，离心后发现管里有很多的胶状物，非常粘稠，有点像鼻涕！多加裂解液稀释一下仍然没有效果，蛋白浓度还变得很低。不死心的我把它戳出来玩了一会，戳戳戳仍然是一大团，这粘稠物是什么？对我的后续实验会有什么影响？」当你看到这团粘稠的「鼻涕」，就意味着你即将经历下面五个难题的考验： 1. 样品吸液困难堵塞移液器：离心后吸上清液的时候胶状物会堵塞移液器头，移液后上清液所剩无几。无法分离上清液：样品太过粘稠，移液吸取时会整体带出，无法分离上清液。 2. 定量困难无法测定及定量：样品粘稠无法成为均一液体，导致蛋白定量 OD 值 out，无法进行定量测定。 3. 样品很难进入胶孔上样困难：尽管加了 loading 进行煮样，上样样品仍然特别粘稠，很难加入到胶孔。 4. 样品很难跑出孔发生拖带电泳结果不佳：SDS-PAGE 时粘稠样品会卡在点样孔里，条带不成直线，有很严重拖尾，条带不集中。 5. 粘稠的样品通常无法获得好结果蛋白丢失：粘稠物包裹蛋白导致无法释放，样品很难跑出理想的结果，有时甚至是完全没有条带。令人反感的粘稠「鼻涕」是怎么形成的？问题出在细胞裂解过

实验室中时常听到这样的困惑，「明明通过免疫荧光（IF）能看到目的蛋白表达在细胞核膜上的表达，但为什么不论用总蛋白还是核蛋白进行 WB 检测，都无法检测到目的蛋白？」 类似这样的问题，你是否也深有感触？实际操作过程中，是否遇到过免疫荧光有结果而蛋白印迹却没条带的情况？什么原因导致了这种情况？又该如何处理？ 一、IF & WB免疫荧光（IF）和免疫印迹（WB）都是利用抗原和抗体的特异性结合对目的蛋白质进行检测。IF 采用抗体和荧光检测固定细胞或组织中目的蛋白的定位、相对表达和激活状态；而 WB 则通过分析条带位置和着色条带深度来获取目的蛋白质在细胞或组织中表达情况的信息。IF 的数据评估依赖于视觉判断，其结果的解释具有主观性[1]。因此，通常情况下，IF 实验更适合对目的蛋白分布范围、空间相互关系进行评价；而 WB 实验常用于对目的蛋白进行定性和半定量分析[2]。二、可能的原因IF 实验是原位检测技术，而 WB 实验则需要先将靶蛋白提取出来再进行检测。IF 实验能检测到目的蛋白，而在 WB 中却没有出现目的条带，其常见的原因有两个：一是目的蛋白表达量过低，无法达到 WB 检测下限；

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物病毒的总称，在电子显微镜下有三种形态：蝌蚪形、微球形和丝形，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。跟别的病毒一样，噬菌体只是一团由蛋白质外壳包裹的遗传物质，大部分噬菌体还长有“尾巴”，用来将遗传物质注入宿主体内。噬菌体颗粒感染一个细菌细胞后可迅速生成几百个子代噬菌体颗粒，每个子代颗粒又可感染细菌细胞，再生成几百个子代噬菌体颗粒。当把细菌涂布在培养基上长成一层菌苔时，一 ...

2019 年 10 月 8 日，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了诺华的 Beovu®（brolucizumab）注射剂用于治疗 wet-AMD，这是 FDA 批准的首个兔源单抗药物。Beovu（brolucizumab）的本质是一种人源化单链抗体片段（scFv），是目前达到开发阶段的临床上最先进的人源化单链抗体片段。单链抗体片段体积小、组织渗透性强、可从全身循环里快速清除及其药物释放特性，其在药物开发中备受追捧。单克隆抗体技术 ...

抗体是机体免疫系统的重要效应分子，其结构多样，可特异识别抗原，并且自身之间可相互识别。抗体在现代医学中起着重要的作用，被广泛地应用于实验室研究、疾病的诊断与治疗。抗体技术发展经历了四个阶段：第一代：杂交瘤单克隆抗体技术；第二代：嵌合抗体和人源化改造单克隆抗体技术；第三代：全人重组抗体技术；第四代：天然全人重组抗体技术。过去由于均质性的全人重组抗体通过传统的制备方法很难大量获得，限制了抗体的大规模临床应用。而 90 年代 ...

​纳米抗体 (nanobody,Nb)， 即重链单域抗体 VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody) ，该类抗体只包含一个重链可变区 (VHH) 和 CH2，CH3 区，相比于其他抗体，轻链天然缺失。纳米抗体晶体直径 2.5nm，长 4nm，是自然存在的可以和抗原结合的最小片段。纳米抗体类型纳米抗体和传统抗体的优劣对比性能传统抗体纳米抗体抗体表达表达时易形成包涵体，互相沾粘聚集沉淀。表达量高，表 ...