Mol Cell：杨薇等揭示 DNA-PK 的激活机制以及自磷酸化对 NHEJ 通路的重要作用
丁香实验
DNA 双链断裂可由外在因素（电离辐射和活性氧等）或内在因素（DNA 复制错误和 V（D）J 重组等）造成，从而激发 DNA 损伤应答，包括 DNA 修复、细胞周期调控、细胞衰老和细胞凋亡等。
DNA 损伤应答由 PIKK（phosphoinositide-3-kinase-related kinase）家族蛋白激酶催化下游蛋白的磷酸化而启动，包括 DNA-PK（DNA 依赖性蛋白激酶）、ATM（Ataxia Telangiectasia Mutated）和 ATR（ATM-Related and Rad3-Related）三种激酶。
其中，DNA-PK 是非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）通路中的关键蛋白激酶，由 DNA-PKcs（DNA-PK 催化亚基）、Ku70/80 和 DNA 末端组成，其全酶装配会进一步招募 NHEJ 相关的连接酶和修复蛋白，包括 DNA 连接酶 IV、XRCC4（X-ray cross complementing protein 4）、XLF（XRCC4-like factor）和 Artemis 等。
由于激酶结构域的底物结合口袋被其自身的 PRD（PIKK regulatory domain）所阻挡，apo 状态的 DNA-PKcs 的激酶活性处于抑制状态，DNA-PKcs 只有在结合 DNA 末端和 Ku70/80 后，激酶活性才会被完全激活，从而启动 NHEJ 通路。NHEJ 相关突变会引起生长迟缓、胚胎致死以及免疫缺陷等，同时 DNA-PK 还是关键的癌症药物靶点。
DNA-PKcs 和 DNA-PK 大部分结构只有中等分辨率（4.3-6.6 Å），且存在建模错误 [1-3]。最近，Blundell 组报道了 3.24 Å 的 apo-DNA-PKcs、3.9 Å DNA-PK 单体和 7.24 Å DNA-PK 二体等的冷冻电镜结构，DNA-PK 二聚化由 Ku80 的最靠近 C 端的 ⍺ 螺旋所介导，揭示了 NHEJ 通路初期 DNA 末端远端匹配的可能机制 [4]。
尽管如此，以上所有报道的结构都为抑制态，激酶结构域的激酶活性中心都处于封闭状态，无法解释 DNA-PKcs 是怎么结合 Ku70/80 和 DNA 末端以及怎么被它们激活的，且由于冷冻电镜 map 的局部分辨率不够高，无法较精确地描述蛋白 - 蛋白和蛋白 - DNA 作用界面以及无法解释已报道的 DNA-PKcs 的关键致病突变和磷酸化位点。
2020 年 12 月 31 日，Molecular Cell 在线发表了美国国立卫生研究院消化道、糖尿病和肾病研究所杨薇院士课题组与 Martin Gellert 院士课题组的研究成果：Structure of an activated DNA-PK and its implications for NHEJ（陈学敏博士为论文第一作者）。
他们报道了 DNA-PKcs-DNA 末端和 DNA-PK 全酶的不同状态的冷冻电镜结构（3.2-4.3 Å），首次展示了激活态 DNA-PK 结构，解释了 DNA-PKcs 亚基识别 DNA 末端和 DNA-PK 逐步被 Ku70/80 和 DNA 末端所激活的分子机制，为 NHEJ 通路中 DNA-PK 如何招募其他修复蛋白提供重要启示。
首先，作者通过在 DNA 的关键弯曲位置引入一个切刻，发现 DNA-PK 的激酶活性可被提高至少 3 倍。使用此切刻 DNA，组装和纯化了 DNA-PK 蛋白样品并收集了大量冷冻电镜数据。
电镜数据处理和 3D 分类发现，样品中存在不同状态的复合物结构，有 DNA-PKcs-DNA 末端（不含 Ku70/80）和 DNA-PK 全酶两种组装状态，而两种状态又可细分为 6 种构象，命名为复合物 I-VI。
复合物 I 和 II 为 DNA-PKcs-DNA 末端复合物的两种构象，区别在于 NH1 亚结构域和 DNA 末端的位置不同，其激酶结构域都处于抑制状态。
复合物 III-VI 为 DNA-PK 全酶的四种构象，其中 III-V 为抑制态，通过 Ku70/80 和 DNA 末端的充分结合以及 DNA-PKcs 的全局构象变化，最终 DNA-PK 转变为激活态复合物 VI。
不同状态 DNA-PK 的总体结构。
A 为激活态 DNA-PK 复合物 VI 的结构模型；B 为 DNA-PK 各亚基的结构域分布图以及全酶样品的 SDS-PAGE 图；C 为不同状态复合物的冷冻电镜 map。
通过结构比对发现，在 DNA-PK 激活过程中：DNA-PKcs 的 M-HEAT 结构域在复合物 I-VI 之间只发生了轻微构象变化；N-HEAT 的 NH1 亚结构域则发生逐步向上的构象变化，收紧 N-HEAT 环，最终与 M-HEAT 的 MH3 亚结构域和 FAT 的 FR2 亚结构域相互作用；FAT 结构域内的相邻 HEAT 重复序列之间则发生相反反向的扭转和拉升，激活态复合物 IV 中 FR2 与 NH1 相互作用；
最终，Ku70/80 和 DNA 末端将 DNA 损伤信号通过 DNA-PKcs 亚基上的 HEAT 重复序列的「彩虹圈式」构象变化传递到激酶结构域，PRD 发生 115° 外翻，解除激酶活性中心抑制态，暴露 DNA-PK 的底物结合口袋，催化 DNA-PK 自身和下游修复蛋白的磷酸化。
令人意外的是，在 DNA-PK 组装和激活过程中，DNA-PKcs 才是识别 DNA 末端的关键亚基，而 Ku70/80 的开放性拓扑结构只能在 DNA 主链上滑动，Ku70/80 通过与 DNA-PKcs 的 N-HEAT 和 M-HEAT 结构域以及 DNA 的相互作用，进一步稳定了 DNA-PK 对 DNA 末端的结合，使 DNA-PK 在激活过程中不会松散。
另外，本研究也更完全的揭示了 Ku80-CTR 结构域在 DNA-PK 激活中的重要作用，除了 Ku70/80 的核心（⍺/β 结构域和 β 桶结构域）与 DNA-PKcs 的 N-HEAT 个 M-HEAT 结构域相互作用以外，Ku80-CTR 的螺旋 548-555、结构域 595-706 和螺旋 724-732 也分别固定了 DNA-PKcs 底座的四个角，对 DNA-PK 激活起到固定和促进作用。
DNA-PK 激活过程中的结构变化 A-D 分别为 N-HEAT、M-HEAT、FAT 和激酶结构域的构象变化，PQR 无序部分结构显示为虚线，底物 ATP 和多肽显示为棍棒模型，E 为 激活态 DNA-PK 复合物 VI 的底部视图。
DNA-PKcs 含有两簇自磷酸化位点，位于 M-HEAT 两个无规区域，其中，PQR 簇位于氨基酸序列 1982-2093 之间，ABCDE 簇位于氨基酸序列 2566-2788 之间。
虽然由于结构柔性，PQR 簇的大部分 loop 区域无法搭建，但电镜 map 能够观察到其两个螺旋 A7 和 A8 ，以前的结构模型错误地将 A7 归属于 Ku80 的 CTR 结构域。
同时，由于分辨率的提高以及晶体结构 [1] 的硒代甲硫氨酸位置，也可以正确的定位和搭建螺旋 A8，PQR 簇远离 DNA-PK 自身活性中心且大部分结构都位于 DNA 末端延长位置上，因此作者推断 PQR 簇只能被相邻的 DNA-PK 分子磷酸化，以及其磷酸化将会在影响 DNA-PK 对 DNA 末端的结合和对其他修复因子的招募。
在以前发表的 DNA-PK 结构中，只有 Blundell 组观察到了 ABCDE 簇的部分结构，位于 M-HEAT 大环内部，而杨薇组冷冻电镜 map 发现 ABCDE 簇位于 M-HEAT 大环外部（由于 DNA 末端与 DNA-PKcs 具有更紧密的结合），紧邻 DNA-PK 自身的激酶活性口袋，提示了 ABCDE 簇可以被 DNA-PK 自身磷酸化。
同时结构比对发现，当 DNA-PK 从抑制态（复合物 V）转变成激活态（复合物 VI），DNA 末端有一个大约 2 Å 的外移，因此可以推断，ABCDE 簇在自磷酸化过程中，DNA 末端变得更容易被 NHEJ 修复蛋白所捕获，从而被相关核酸酶、连接酶和修复蛋白处理和修复。
另外，ABCDE 簇的去磷酸化可以恢复 DNA-PK 让 DNA 末端再次被保护起来，从而形成 DNA-PK 的磷酸化 - 去磷酸化循环。
综上，该工作报道了 DNA-PK 的从抑制态到激活态一系列冷冻电镜结构，展示了断裂 DNA 末端是怎么被 DNA-PKcs 亚基感应并组装成全酶结构，再通过 DNA-PKcs 上的 HEAT 重复序列将信号传导到激酶活性中心，将 DNA-PK 从抑制态转变成激活态，从而磷酸化 DNA-PK 自身和大部分 NHEJ 修复蛋白，最终启动 NHEJ 通路来完成 DNA 修复。
另外，该工作还提出，「彩虹圈式」的 HEAT 重复序列具有结构柔性，可能在很多含 HEAT 重复序列的蛋白中具有重要调控功能，如 PIKK 激酶、凝集素（Condensin）、黏附素（Cohesin）和核转运蛋白（Karyopherin）。
