微量环境样本/微生物核酸提取

环境样本中的核酸，主要来源包括微生物以及生物脱落的组织、分泌物、排泄物、血液或尸体等，分布在各种水体、土壤、沉积物或空气等环境中，是微生物和脱落核酸的混合物，这两类核酸在上述环境样本中存在较少。不同来源的水体和土壤是环境相关研究课题的主要样本类型。

经过前处理的水体或土壤样本通过机械珠磨研磨方案搭配强力化学裂解液进行破碎和匀浆处理，快速有效地使难裂解微生物样本最大限度充分释放核酸，然后通过 QIAGEN 独有的抑制因子去除技术（IRT, Inhibitor Removal Technology）方便快捷地彻底去除残留的抑制因子，确保下游定量 PCR 和 NGS 检测的准确性，随后将液体加载到硅胶膜柱上是核酸进行核酸的特异性结合，洗涤掉杂质后即可洗脱得到核酸。

1、向 PowerBead Tube 中加入 200 μl 液体样本。

注：如果希望进行酚裂解，可以在 PowerBead Tube 中加入 100 μl 酚：氯仿：异戊醇 (pH 6.5–8)。

2、向 PowerBead Tube 中加入 600 μl Solution PM1/ β-巯基乙醇混合液。

3、把 Bead Tubes 水平固定在 MO BIO 的涡旋仪适配器（货号：13000-V1-24）上。 Tube 管帽应朝向涡旋适配器 中心。

4、最大转速连续涡旋振荡 10 min。

5、室温 13000 g 离心 1 min。转移上清到一个干净的 2 ml Collection Tube（试剂盒提供）  中。预期上清液约 600 μl。 若使用了苯酚：氯仿：异丙醇， 转移上面水相层到干净的 2 ml Collection Tube  （试剂盒提供）  中。

6、加入 150 μl Solution IRS，简单涡旋混匀，4℃ 孵育 5 min。

7、13000 g 离心 1 min。避开沉淀，把上清转移到一个干净的 2 ml Collection Tube（试剂盒提供）  中。此步不能取多于 700 μl 的上清。

8、加入 600 μl Solution PM3 和 600 μl Solution PM4 。简单涡旋混匀。

注：要回收小片段 RNA，如 microRNA 和 siRNA，把裂解物转移到能容纳至少 2.5 ml 的 Tube 管中，另 外加入 600 μl 100% 乙醇。此步所需的 100% 乙醇自备。

9、转移 625 μl 上清到 MB Spin Column，13000 g 离心 1 min。去除穿出液，重复操作转移上述剩下的上清到 MB Spin Column。

注：每个样品共需反复转移 3 次上清， 若为回收 microRNA 和 siRNA 而是用了额外的 100% 乙醇，则共需 4 次转移。

10、Solution PM5 使用前先摇匀。加入 600 μl Solution PM5 到 MB Spin Column，13000 g 离心 1 min。

11、去掉穿出液。加入 600 μl Solution PM4 到 MB Spin Column，13000 g 离心 1 min。

12、去掉穿出液，13000 g 离心 2 min。

13、把 MB Spin Column 放到一个干净的 2 ml Collection Tube  （试剂盒提供）  中。

14、加入 100 μl RNase-Free Water 到 MB Spin Column 白色柱膜中心，并润湿整个膜。静置至少 1 min。

注：使用 100 μl RNase-Free Water 能获得 DNA/RNA 的最大洗脱效率。要浓度更高的 DNA/RNA，RNase-Free Water 最少可只用 50 μl 。RNase-Free Water 用量不能少于 50 μl。

15、13000 g 离心 1 min。丢弃 MB Spin Column。DNA/RNA 即可用于下游实验，样本保存在-80℃。

操作前注意事项：

预热 Solution PM1, 55℃ 加热 10 min 直至沉淀溶解，使用前震荡混匀，趁热使用。提取 RNA 时，向 Solution PM1 中加入 β-巯基乙醇，注意：最好新鲜配制使用，β-巯基乙醇浓度为 10 μl/ml。

内容来源： QIAGEN 凯杰