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        α 突触核蛋白硫磺素T检测操作步骤

        相关实验:α突触核蛋白活体建模及其他活性测试

        最新修订时间:

        原理

        硫黄素 T (Thioflavin T) 是一种荧光染料,可以和富含 β 折叠的结构结合,例如 α-突触核蛋白原纤维。一旦结合,硫黄素T 的发射光谱就会发生红移 ,并且荧光强度会增强,这是一个很好的用来检测原纤维形成的测试。以下是用 α-突触核蛋白前体原纤维和单体做的硫黄素T 检测的操作指南。

        材料与仪器

        材料:硫黄素T、PBS、蒸馏水、0.2μm 注射器过滤器、96 多孔孔板

        仪器:移液器、全波长荧光型酶标仪、震荡孵育器

        步骤

        1. 用蒸馏水制备 1mM 硫黄素T 储备溶液 (新鲜制备并使用 2μm 注射器过滤器过滤)。

        2. 用 PBS pH7.4 稀释硫黄素T,确保每个孔中的硫黄素T最终浓度为 25μM (每孔溶液体积= 100μL). 孔板: 96 多孔孔板.

        3. 在将要使用之前才把 alpha 突触核蛋白小份在室温下解冻。

        4. 在相应的孔中加入 10μM 前体原纤维或者 100μM 单体 (或两者都有). 用移液器将孔中液体上下吸入排出混合. 浓度为估计值,需要优化来得到好的信号,并避免浪费。

        5. 密封孔板然后置于震荡孵育器中 (600rpm),37°C 孵育。

        6. 用酶标仪读取荧光读数。

        7. 再次密封孔板置于震荡孵育器下 37°C。

        8. 在1 到 72 小时常规区间读数。

        注意事项

        全波长荧光型酶标仪设置参数:

        温度: 37°C
        读取形式: 孔板扫描
        波长: 激发光 450 nm,发射光 485nm
        PMT 增益: 自动
        闪光每读: 6
        震荡: 读数前 20 秒

        来源:丁香实验

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