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        α 突触核蛋白沉降试验操作步骤

        相关实验:α突触核蛋白活体建模及其他活性测试

        最新修订时间:

        材料与仪器

        材料:微量离心管(螺帽管)、Laemmli 缓冲液、PBS、SDS-PAGE 所需材料

        仪器:离心机,SDS-PAGE 所需仪器

        步骤

        1. 将 40μL 的 PFF 移入微量离心管中(最好是螺帽管)。

        2. 最大速度离心 60 分钟。

        3. 小心将上清液 (40μL) 转移到新管中。添加 10μL 的 5X Laemmli 缓冲液并标记为「上清液」。

        4. 将沉淀悬浮于 40μL PBS 中,再次最大速度离心 30 分钟。保存上清液并标记为 「洗涤」 。

        5. 将沉淀物悬浮在 40μL PBS 中并标记为 「沉淀物」 ,向该部分添加 10μL 5X Laemmli 缓冲液。

        6. 90°C 孵育 10 分钟。

        7. 分别加样 10μL 「上清液」,「洗涤」和「沉淀物」于 15 孔梳 SDS-PAGE 凝胶,然后进行 SDS-PAGE。考马斯亮蓝染色和脱色。我们希望大部分的 alpha 突触核蛋白 (>75%) 存在于「沉淀物」中。

         

        注意事项

        原始操作步骤建议使用 40μL,但我们发现 20μL 也可以,并能节省样品。此外,我们有时会在第二次离心时运行 60 分钟,而不是建议的 30 分钟,以确保获得更好的沉淀物。该沉降试验应在在原纤化结束时进行,之后再稀释和分装。

        来源:丁香实验

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