Gateway 克隆（入门载体的构建）

Gateway 克隆属于高效大规模克隆系统，是利用载体上一系列特殊的酶，可以高效、方便、快速地将不同 DNA 序列拼接在一起，将目的基因克隆到受体上用于重组表达载体、RNA 干扰载体、报告基因载体等等。

Gateway 系统建立在噬菌体 DNA 定点整合到细菌宿主基因组上，入门载体的构建包含两个重组位点序列 attL 和 attR，在噬菌体和细菌的整合因子作用下，attL 位点和 attR 位点可以发生定点重组，噬菌体 DNA 能够整合到细菌基因组中，从而利用 PCR 重组克隆、限制性克隆等方法可以构建入门载体。

入门载体包含两个重组位点序列 attL1 和 attL2，大小均为 100bp，中间夹着一个自杀基因——ccdB 基因。由于 ccdB 基因的表达产物能抑制普通的 E.coli 生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。

Gateway 克隆技术可以用于构建各种表达载体、RNA 干扰载体和报告基因载体等。通过 Gateway 技术，可以方便快捷地将多个基因片段组合成一个表达载体，从而实现对基因表达的调控、表达定位和功能研究等。

使用transwell方法检测内皮细胞迁移的步骤如下：

1、合成 PCR 引物：即 GGGG-attB1 或者 attB2 序列（25bp）-基因特异性序列（18 到 25 个碱基或以上），这样在 PCR 扩增目的基因时就可以直接得到两端带有 attB1/2 基因的片断。

2、将 PCR 产物直接与上述的供体载体（带有 attP1-ccdB（自杀基因）-attP2 序列）混合

3、加入 BP 重组混合酶，25 度保温 1 小时。

4、37 度蛋白酶 K 处理 10 分钟，即可转化并得到带有目的基因的入门载体。

1、这个产物最后是需要测序鉴定的，并且克隆到入门载体的基因不能表达，所以不能用抗体筛选检测。

2、由于 attB1 的末端（第 25 个碱基）是 T，所以跟在后面的基因特异性序列的头两位碱基不能是 AA、AG 和 GA 以免提前出现终止密码。

3、得到的入门克隆中，目的基因两侧具有 attL 重组位点，可以与任何 Gateway™ 目的载体进行重组。