简介
本篇 protocol 给大家介绍一种能够从杨树单个细胞核而不是整个细胞中表征 mRNA 的方法帮助大家减少因制备原生质体而带来的问题。
材料与仪器
1.实验材料
样本：
杨树梢尖（Populus tremula × alba INRA clone 717 1B4）和杨树茎（nisquly -1），两种材料均具有不同程度的细胞复杂性和细胞壁结构。
试剂：
10 牛血清白蛋白封闭液、RNase 抑制剂、盐酸精胺、亚精胺、DTT、4X 细胞核分离缓冲液（40 mM MES-KOH pH 5.7, 40 mM NaCl, 40 mM KCl, 12mM MgCl2, 10 mM EDTA, 1M sucrose）、细胞核分离洗脱缓冲液（40 mM MES-KOH pH 5.7, 40 mM NaCl, 40 mM KCl, 12 mM MgCl2, 1M sucrose）
耗材：
镊子、无菌刀片、玻璃平板、移液枪、40uM 滤网、5ml 带帽试管、50ml 离心管、1.5ml RNase-free 低吸附管
实验设备：
低温离心机、 恒温摇床、细胞分选仪等
步骤
2.详细实验步骤解析
Step 1
准备 20 个杨树解剖梢尖，或一个单独的杨树茎。
Step 2
用刀片刮下组织于 200ul 的细胞核分离缓冲液中，杨树茎用 400ul 的缓冲液，均静置 2min，此操作重复两次（杨树梢尖）或三次（杨树茎），每次间隔 30s。
Step 3
组织匀浆分别用移液管转移至有 5ml 细胞核分离缓冲液中，置于摇床缓缓水平摇晃 5min。
Step 4
用缓冲液预湿过的滤布过滤组织匀浆，再用 40um 细胞过滤器过滤至 50ml 离心管中，用低温离心机 4℃，600g 离心 5min。
Step 5
离心后小心去除上清液，沉淀用 4ml 细胞核分离洗脱液重悬，低温离心机 4℃，600g 离心 5min。
Step 6
重复步骤 5，洗脱液洗脱两次。第二次洗脱后，沉淀用 750ul （杨树梢尖）或 1000ul（杨树茎）的洗脱液重悬，并转移到分选机适用的 5ml 分选管中。
Step 7
5ug/ml DAPI 染核，室温静置 5min，采用细胞分选仪（BD FACSAria IIU/III）在10-20min 内分选细胞核。分选后细胞核最终浓度约为 500个/ul。取 5-10ul 在共聚焦显微镜下观察细胞核的完整性，质检合格后的样本可用于 cDNA 合成。
Step 8
将约 20000 个质控合格的细胞核利用 10x Genomics 平台捕获，后续按照protocol 构建 cDNA 文库和测序获得数据。
3.制核效果验证
如上操作方法尽量减少了叶绿体等细胞器的污染和可能堵塞微流控芯片的细胞碎片，从制核结果来看，研究者获得了 40000 个 DAPI+ 核（总回收体积 67-70μl），可用于后续单细胞核测序实验。
基于10x Genomics 平台的细胞核捕获及数据分析结果，测序数据基本饱和的情况下，Mean Reads per Nucleus 在 43000 左右，mapping 率＞73%，杨树茎组织的 2 个重复显示了表达基因之间的高度共性。
4.杨树组织细胞核制备注意事项
（1）细胞核分离开始前，需将实验中所用的所有溶液、无菌刀片、各个规格的离心管、移液管等所需工具放置于 0-4℃ 预冷至少 30 分钟，并在实验过程中保持低温状态（置于冰上）。
（2）整个实验过程需在冷室低温环境下操作，以减少 RNA 降解。
（3）整个实验过程从植物材料收集到最终的分选，应在 90 分钟内完成，以减少 RNA 污染和降解。
（4）制作组织匀浆时，应保证所有植物材料必须与含有 RNA 降解抑制剂的缓冲液接触。由于在样品制备的这一阶段可能会发生 RNA 降解，因此可以事后进行RNA提取和质量评估以验证其完整性。
（5）离心、洗脱、转移匀浆等步骤操作均在冰上进行。
参考文献：
A robust method of nuclei isolation for singlecell RNA sequencing of solid tissues from the plant genus Populus. PLoS One 2021 May 11;16(5):e0251149
文章来源：烈冰生物
来源：丁香实验
