单细胞测序实验之—样本的获取及运输

1、新鲜组织样本

新鲜组织样本包括实体瘤组织样本和临床穿刺样本，实体瘤组织样本常见于患者切除的组织、实验模型动物的脏器组织等，而穿刺样本是指在采集样本过程中使用粗针(穿刺针针管外径≥1.2 mm)穿刺采集 3-5 条样本。

（1）针对于实体瘤组织样本，在取样过程中应注意：

① 实体瘤组织需新鲜的样本，且没有经过冷冻、固定等处理。

② 取样后的组织上不能有血凝块，可以在取样后使用 PBS 清洗粘在组织块上的血液。

③ 运输前，要将组织放置在组织冻存液或缓冲液（注意应无钙、镁、EDTA 等影响酶活性物质，可使用 0.04% BSA 的 PBS）。

④ 4℃ 条件下暂存及运输，通常将组织放置在冰盒中运输。

（2）实际操作步骤：

① 取好所需组织块后，将组织块切成黄豆粒大小(100mg 左右)小块，如组织内细胞含量十分多，可以切成绿豆粒大小，方便细胞分选。细胞量要尽量保证在 1×10⁶ cells 以上；

② 用无菌 PBS (或无菌生理盐水)清洗 2 遍，立即放入预冷的组织保存液中，用塑料泡沫包裹置于 4℃ 冰盒中暂存。

③ 样本收集完毕后，需在 24 小时内送到实验室内制备成细胞悬液。

(实体瘤组织样本，图片来源：烈冰助力单细胞文章https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.04.027)

（3）针对于穿刺组织样本，在取样过程中应注意：

穿刺组织样本中包含的细胞数量至少应达到 1×10⁵ cells 以上，细胞活性大于 70%。

穿刺样本在采集过程中可以使用粗针(穿刺针针管外径≥1.2mm )穿刺采集 3-5 条样本，但不能用真空针采样。

(穿刺组织样本，图片来源：网络）

2、外周血样本及 PBMC 样本

外周血（全血）做单细胞测序通常是分析粒细胞，而外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞，通常分析药代动力学相关的内容时，二者都是研究人体细胞异质性的重要样本。

（1）针对于外周血样本，在取样过程中应注意：

① 外周血（全血）样本取样时需置于 EDTA 抗凝管中；

② 采血管无破损，血液离体后不超过 48h，EDTA 抗凝管没有过期，全血体积≥5mL，样本无严重溶血、无血凝块；

③ 在样本量充足的情况下，可以多设置 1-2 组重复；

④ 在寄送装有血液的抗凝管时，需用泡沫包裹，保证 4℃ 左右的低温环境；

⑤ 2-8℃ 条件下暂存及运输。

（2）针对于 PBMC 样本，一般 PBMC 分离方法如下：

实验流程：

① 抗凝血使用前需颠倒混匀；

② 准确量取抗凝血体积并加入等体积的 PBS，平放离心管，缓慢旋转管壁数次，以使 PBS 和血液混匀；

③ 在另一离心管中加入与混合液等体积的淋巴细胞分离液，将淋巴细胞分离液的离心管倾斜成和水平面 30-45 度角，然后另一手拿混合管沿着淋巴细胞分离管管壁，慢慢倒入淋巴细胞分离管中，（注意：最开始倾倒时，需缓缓倒入，而且倒入后需等待数秒，再继续倾倒）。待抗凝血铺满分离液液面时，可稍加速倾倒，随着分离液管中血液的增多，需将分离管缓慢竖直。

④ 待血液完全倒入分离管后，可以看到分离液和血液有明显分层。离心管尽量减少震动，对称放入离心机中。800g 离心 20min。如果取样时间较长（2h 以上），可延长离心时间至 30min。离心结束后，将离心管从适配器中旋转取出。此过程应缓慢，尽量避免震荡。

⑤ 直接将吸管深入中间层，沿着管壁缓慢吸入，并不时移动吸管，将淋巴细胞转入一个新的 1.5ml 离心管中。

⑥ 将离心管放入离心机中，400g 离心 10min。用 200ul 枪头缓慢吸取离心管中液体，吸取过程中避免吸到细胞沉淀，完全吸干净液体。

获得 PBMC 后，向离心管中加入相应试剂，进行后续实验。