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        单细胞测序实验之—样本的获取及运输

        相关实验:单细胞多组学

        最新修订时间:

        简介

        通常,单细胞测序选择的样本组织是新鲜的组织、血液、培养的细胞系或制备好的单细胞悬液。因此如何将样本快速安全的转运到实验室中处理?这是决定单细胞测序质量好坏的一个重要因素,下面我们将给大家介绍几种不同的样本及样本转运前处理:

        材料与仪器

        实体瘤新鲜组织样本

        无菌 PBS (或无菌生理盐水)

        PBS 淋巴细胞分离液(提前从 4℃ 冰箱拿出平衡至室温)

        水平离心机,温度设置在 15-20℃

        10ml 离心管

        全血(EDTA 抗凝管取血)

        步骤

        1、新鲜组织样本

        新鲜组织样本包括实体瘤组织样本和临床穿刺样本,实体瘤组织样本常见于患者切除的组织、实验模型动物的脏器组织等,而穿刺样本是指在采集样本过程中使用粗针(穿刺针针管外径≥1.2 mm)穿刺采集 3-5 条样本。

        (1)针对于实体瘤组织样本,在取样过程中应注意:

        ① 实体瘤组织需新鲜的样本,且没有经过冷冻、固定等处理。

        ② 取样后的组织上不能有血凝块,可以在取样后使用 PBS 清洗粘在组织块上的血液。

        ③ 运输前,要将组织放置在组织冻存液或缓冲液(注意应无钙、镁、EDTA 等影响酶活性物质,可使用 0.04% BSA 的 PBS)。

        ④ 4℃ 条件下暂存及运输,通常将组织放置在冰盒中运输。

        (2)实际操作步骤:

        ① 取好所需组织块后,将组织块切成黄豆粒大小(100mg 左右)小块,如组织内细胞含量十分多,可以切成绿豆粒大小,方便细胞分选。细胞量要尽量保证在 1×106 cells 以上;

        ② 用无菌 PBS (或无菌生理盐水)清洗 2 遍,立即放入预冷的组织保存液中,用塑料泡沫包裹置于 4℃ 冰盒中暂存。

        ③ 样本收集完毕后,需在 24 小时内送到实验室内制备成细胞悬液。

        单细胞测序实验之—样本的获取及运输

        (实体瘤组织样本,图片来源:烈冰助力单细胞文章https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.04.027)

         

        (3)针对于穿刺组织样本,在取样过程中应注意:

        穿刺组织样本中包含的细胞数量至少应达到 1×105 cells 以上,细胞活性大于 70%。

        穿刺样本在采集过程中可以使用粗针(穿刺针针管外径≥1.2mm )穿刺采集 3-5 条样本,但不能用真空针采样。

        单细胞测序实验之—样本的获取及运输

        (穿刺组织样本,图片来源:网络)

         

        2、外周血样本及 PBMC 样本

        外周血(全血)做单细胞测序通常是分析粒细胞,而外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是外周血中具有单个核的细胞,包括淋巴细胞和单核细胞,通常分析药代动力学相关的内容时,二者都是研究人体细胞异质性的重要样本。

        (1)针对于外周血样本,在取样过程中应注意:

        ① 外周血(全血)样本取样时需置于 EDTA 抗凝管中;

        ② 采血管无破损,血液离体后不超过 48h,EDTA 抗凝管没有过期,全血体积≥5mL,样本无严重溶血、无血凝块;

        ③ 在样本量充足的情况下,可以多设置 1-2 组重复;

        ④ 在寄送装有血液的抗凝管时,需用泡沫包裹,保证 4℃ 左右的低温环境;

        ⑤ 2-8℃ 条件下暂存及运输。

        (2)针对于 PBMC 样本,一般 PBMC 分离方法如下:

        实验流程:

        ① 抗凝血使用前需颠倒混匀;

        ② 准确量取抗凝血体积并加入等体积的 PBS,平放离心管,缓慢旋转管壁数次,以使 PBS 和血液混匀;

        ③ 在另一离心管中加入与混合液等体积的淋巴细胞分离液,将淋巴细胞分离液的离心管倾斜成和水平面 30-45 度角,然后另一手拿混合管沿着淋巴细胞分离管管壁,慢慢倒入淋巴细胞分离管中,(注意:最开始倾倒时,需缓缓倒入,而且倒入后需等待数秒,再继续倾倒)。待抗凝血铺满分离液液面时,可稍加速倾倒,随着分离液管中血液的增多,需将分离管缓慢竖直。

        ④ 待血液完全倒入分离管后,可以看到分离液和血液有明显分层。离心管尽量减少震动,对称放入离心机中。800g 离心 20min。如果取样时间较长(2h 以上),可延长离心时间至 30min。离心结束后,将离心管从适配器中旋转取出。此过程应缓慢,尽量避免震荡。

        ⑤ 直接将吸管深入中间层,沿着管壁缓慢吸入,并不时移动吸管,将淋巴细胞转入一个新的 1.5ml 离心管中。

        ⑥ 将离心管放入离心机中,400g 离心 10min。用 200ul 枪头缓慢吸取离心管中液体,吸取过程中避免吸到细胞沉淀,完全吸干净液体。

        获得 PBMC 后,向离心管中加入相应试剂,进行后续实验。

        单细胞测序实验之—样本的获取及运输

        (3)样本质控标准

        对于所有制备成细胞悬液的样本,均需要关注采集后样本质量:

        ① 细胞活性大于 70%

        ② 浓度为 700-1200 细胞/μL

        ③ 体积不小于 100 μL

        ④ 细胞培养基及缓冲液不能含 Ca2+ 和 Mg2+

        ⑤ 细胞体积小于 40 μm

        ⑥ 细胞结团率低于 20%

         

        文章来源:烈冰生物

        来源:丁香实验

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